機械灌注對DCD供肝移植術后膽道并發癥影響的研究進展

侯賓，宋紅麗（.天津醫科大學一中心臨床學院，天津 3009；.天津市第一中心醫院器官移植科，天津市器官移植重點實驗室，中國醫學科學院移植醫學重點實驗室，國家衛生健康委員會危重病急救醫學重點實驗室，天津 3009）

目前心臟死亡供體（donation after cardiac death，DCD）肝移植已成為治療患者終末期肝病最為有效的方法［1-3］。之前的研究表明，DCD肝移植術后膽道并發癥發生率為10%～30%，是肝移植后發病甚至死亡的主要原因，嚴重影響術后患者移植物功能恢復以及患者的生存狀況［4-7］。因此，DCD肝移植受者術后膽道并發癥的高發病率引起了廣泛關注，以期對發病機制有更深入的了解，從而可以制定預防策略。因此，為了深入了解機械灌注保存DCD供肝對肝移植術后膽道并發癥的發病機制，提高患者生活質量，本綜述對此進行詳細歸納。

1 DCD肝移植術后膽道并發癥的分型和形成因素

膽道并發癥可以分為3種類型：膽漏、吻合口狹窄（anastomotic stenosis，AS）和非吻合性膽道狹 窄（non-anastomotic biliary stenosis，NAS）［8］。其中AS和NAS是DCD肝移植后膽道并發癥中最常見的類型，發生率分別為1%～15%和5%～30%［8］。研究證實，肝移植術后膽道并發癥的產生主要是3個相互關聯的機制引發：缺血/再灌注損傷（ischemia reperfusion injury， IRI）、免疫炎癥反應介導的組織損傷以及細胞毒性膽汁鹽誘導的損傷［9-10］。這3個機制通常相互作用，共同導致膽道并發癥的產生，進而嚴重影響患者術后移植物功能。

因此，通過減少IRI、免疫炎癥反應介導的組織損傷以及細胞毒性膽汁鹽誘導的損傷則成為預防DCD肝移植術后膽道并發癥產生的關鍵目標［11-13］。其中，IRI被普遍認為是誘發肝移植術后膽道并發癥產生的最重要因素，因此，如何有效減少供肝IRI從而降低DCD肝移植術后膽道并發癥的發生率，成為目前的研究熱點［11-13］。

2 機械灌注保存DCD對肝移植術后膽道并發癥的作用

2.1 機器灌注的原理：研究表明采用機械灌注保存供肝的方法能夠通過補充氧和營養物質，減少供肝ATP丟失，促進保護性蛋白的產生，顯著減少供肝IRI，從而改善邊緣供肝移植手術的療效［14］。在器官移植初期，傳統的靜態冷保存由于價廉、技術便捷等原因開始成為器官移植保存的金標準［15-17］。然而，隨著近幾年DCD肝移植技術的不斷改善，邊緣性供肝的利用不斷增加，這類供肝會導致移植物功能障礙以及膽道并發癥發生率的增加［11-12］。因此，在肝移植過程中，采用體外對DCD供肝進行灌注保存的方法已成為目前器官移植保存的新方向。

2.2 機器灌注的應用：目前臨床正在探索不同的供體肝臟機器灌注方法，包括在不同溫度條件下的灌注［11-12，18］。其中，低溫（1～18℃）機械灌注、亞低溫（20～30℃）和常溫（35～37℃）機器灌注的設備已進入臨床實踐和研究［18］。低溫機械灌注是在低溫條件下通過灌注機提供動力從而向供肝中持續泵入灌注液，提供營養支持，從而減輕供肝損傷［18-19］。然而，合理的灌注壓力以及流速對低溫機械灌注過程非常重要，灌注壓力過高或者過低都將嚴重影響肝臟功能，產生供肝IRI［18］。同時當灌注時間超過2 h時，肝移植術后罹患移植物功能障礙的風險將顯著增加，嚴重影響低溫機械灌注的使用［18］。亞低溫機械灌注是介于低溫與常溫之間的灌注模式，Bruinsma等［20］對通過亞常溫機械灌注供肝的研究表明其可以有效維護肝功能，減少IRI。但目前針對于亞低溫機械灌注的研究較少，對于后者的臨床使用需要進一步的研究［18］。與其他灌注模式相比，常溫機械灌注的一個重要優勢在于它可以最大限度地模擬肝臟的生存環境，更好地為供肝提供氧氣和營養支持，并且可以在進行移植之前，對處于正常體溫條件下的供肝進行功能測試［11-12，15-16］。臨床研究表明，常規靜態冷藏后短時間的機械灌注可以顯著減少IRI［21-22］。因此，采用常溫機械灌注保存供肝的方法成為目前的研究熱點。

3 機械灌注保存DCD減少肝移植術后膽道并發癥

3.1 機械灌注減少膽道IRI：目前DCD移植中膽道并發癥發生率較高的主要原因是在肝移植過程中，由于原發性缺血導致DCD供肝缺血期間積累的三羧酸循環中間產物（主要是琥珀酸）會引發肝臟和膽管組織的線粒體功能障礙，引起膽道IRI及后續免疫炎癥反應，進而造成肝細胞和膽管上皮細胞損傷［23-24］。研究表明，膽道上皮的免疫炎癥反應在術后膽道并發癥的發展中發揮至關重要的作用［25］。這可能是由于血管內血凝塊的形成導致PVP血供不足，從而導致膽管細胞發生繼發性缺血損傷，導致NAS的產生［25-27］。其次，表達于DCD供肝中膽管上皮表面的ABO血型抗原，可能與受者膽管上皮表面的ABO抗體發生特異性結合，形成抗原抗體復合物，從而導致膽道上皮細胞直接損傷［25-27］。此外，巨細胞病毒（cytomegalo virus，CMV）感染與吻合口狹窄和膽汁漏有關［28］。研究表明，CMV可以直接引起膽道上皮細胞的損傷，同時，PVP中內皮細胞的感染可能導致微血栓的形成，從而導致膽管壁和上皮的繼發性缺血性損傷［25-26］。最后，趨化因子受體CCR5的突變導致CCR5表達降低，與NAS的發展關系密切［29-31］。CCR5顯著表達于免疫細胞，可以與膽管上皮細胞表面存在的CCR5結合位點特異性結合，因此，當患者CCR5發生突變，CCR5的表達減少將嚴重影響調節性T細胞的趨化，這可能導致炎癥反應加重，加重膽管損傷［32］。

采用機械灌注的方法可以保證供肝在體外保存階段組織內部的血液供應，從而主動降解琥珀酸鹽等代謝產物，減少活性氧（reactive oxygen species，ROS） 的產生，進而抑制下游炎癥因子活化［33］。同時，由于供肝局部缺血導致膽管組織內ATP耗竭，后者消耗的主要途徑包括膽鹽轉運蛋白、離子通道泵和細胞有絲分裂活動［11，34］。而采用機械灌注的方法可恢復線粒體功能并提高肝臟和膽管組織的ATP水平，對于維持再灌注期間肝臟和膽管組織的再生能力至關重要［11-12，34-35］。

3.2 機械灌注減少膽道細胞毒性膽汁鹽的產生：研究表明，患者體內膽汁鹽/膽汁磷脂的異常比例也與術后膽道并發癥的產生密切相關［36］。體內膽汁成分受ATP依賴性膽汁轉運蛋白-膽汁鹽轉運體和多藥耐藥相關蛋白-3（multidrug resistance associated protein 3， MDR3）表達調控，它們分別負責膽汁鹽和膽汁磷脂的分泌［37］。由于移植早期轉運蛋白的數量減少以及膽管細胞內ATP不足而降低，轉運蛋白的功能受到嚴重影響，從而導致高膽汁鹽成分的異常膽汁形成［38］。這種異常膽汁鹽具有強大的“清洗”作用，可通過破壞細胞脂質膜進入細胞后誘導細胞凋亡［29］。而采用機械灌注的方法可恢復線粒體功能并提高肝臟和膽管組織的ATP水平，恢復ATP依賴性膽汁轉運蛋白-膽汁鹽轉運體的表達，平衡膽汁中膽汁鹽和膽汁磷脂的比例，進而減少因異常膽汁引起的肝細胞和膽管上皮細胞的凋亡數量［29，36-38］。引起膽鹽毒性的另一個因素是HCO3-分泌不足。ATP依賴型囊性纖維化跨膜轉導調節因子（cystic fibrosis transmembrane regulator， CFTR）和 膽 管 細 胞Cl-/HCO3-交換體（anion exchanger 2， AE2）共同分泌的HCO3-用于維持膽管細胞附近正常的堿性環境［37］。在堿性環境中，疏水性膽汁鹽被去質子化，使其不能通過脂質細胞膜滲透進入膽管細胞。而肝移植過程中由于膽管局部缺血引起的ATP依賴性CFTR和AE2功能受損，從而無法維持膽管細胞附近正常的堿性環境，從而造成膽管細胞損傷［29，37］。綜上所述，采用機械灌注體外保存供肝的方法可恢復線粒體功能并提高肝臟和膽管組織的ATP水平，顯著增加ATP依賴性膽汁轉運蛋白-膽汁鹽轉運體以及ATP依賴性CFTR和AE2的數量，進而平衡膽汁中膽汁鹽和膽汁磷脂的比例，減少高膽汁鹽成分的異常膽汁，以及通過維持膽管細胞附近正常的堿性環境，減少進入膽管中的疏水性膽汁鹽，從而共同減輕肝細胞和膽管上皮細胞的損傷。

3.3 機械灌注促進膽管上皮細胞的再生與修復：長期以來，人們一直認為膽管上皮內膜的IRI是NAS發展的主要決定因素［23-24］。但是，最近的臨床研究表明，在所有移植肝中，超過90%的膽道上皮出現廣泛損傷和缺失［27，40］。盡管腔內膽管壁出現大面積損傷，但這些肝臟中只有少數會導致移植后膽管病變。因此有人提出決定供體肝臟是否會發展為移植后膽管病的原因在于膽管上皮再生不足，而不是之前普遍認為的膽管損傷程度［41］。除了更好地保護膽管免受IRI外，機器灌注還使移植前供肝的膽管樹再生和修復成為可能。尤其是在常溫條件下，向灌注液內添加刺激膽管周圍腺體內多能干/祖細胞增殖和成熟的藥物，可以及時修復受損的膽管上皮細胞，從而阻止膽道并發癥的產生［27］。由于膽管細胞易受ATP消耗的影響，并且大多數肝膽轉運蛋白都是ATP依賴性的，因此可以認為機器灌注可以更好地保存和保護膽管［27］。

4 結 論

膽道并發癥仍然是DCD肝移植術后最為嚴重的并發癥之一，其高發病率與高死亡率嚴重影響患者術后的生活質量。肝移植術后膽道并發癥的產生主要是多個相互關聯的機制引發的損傷。由于常溫機械灌注對器官的保存技術具有可以維持正常的線粒體功能，恢復肝內ATP濃度，減少ROS的產生等，從而減少移植后膽道并發癥的發生，然而其機制仍值得進一步深入研究。