月經血干細胞來源外泌體在疾病治療中的應用

劉勃彤，劉東哲，陳秀慧

外泌體（exosomes）是由活細胞釋放的納米級小囊泡，可通過其攜帶的生物學信息介導細胞間通訊，參與調控多種生理及病理過程。同時，作為一種納米級顆粒，外泌體能夠穿過血腦屏障等生物學屏障，到達靶器官發揮作用。隨著對外泌體研究的逐步深入，學者們發現了其極大的研究潛能和實用價值，尤其在疾病診斷和治療上的獨特價值越發受到關注，因此成為了當前的研究熱點。月經血干細胞來源外泌體（menstrual blood stem cell-derived exosomes,MenSC-Ex）具有細胞來源無創、應用無倫理學問題和免疫原性低等優勢而極富研究潛力和應用前景。近年來研究發現，MenSC-Ex 在組織修復與再生、腫瘤進程調控以及生殖醫學等方向均表現出卓越的干預作用。

1 干細胞外泌體概述

外泌體是由活細胞釋放的攜帶微小RNA（microRNA，miRNA）/長鏈非編碼RNA（long noncoding，lncRNA）、分泌蛋白和核酸變異體等成分的小囊泡（直徑40～160 nm）[1]。在生物體內，外泌體通過其攜帶的遺傳信息參與細胞信號傳導，調控多種生理、病理過程。一方面，它可以作為“液體活檢”的目標，提供其來源細胞的生物學信息；另一方面，它與免疫反應、心血管疾病、中樞神經系統疾病和癌癥等多種疾病的發生、發展相關[1-2]，因此成為當前研究的熱點。由于外泌體在細胞內含量極低[3]，其相關研究往往需要培養大量細胞才能獲得研究所需量。因此，尋找理想的細胞源成為外泌體研究中的關鍵。干細胞具有強大的自我更新能力和多向分化潛能，在再生醫學和移植學中潛力巨大，然而免疫排斥反應等問題影響了干細胞治療的效果[4]。如果能夠應用攜帶干細胞有效信息的低免疫源性的外泌體進行“無細胞”治療，則可降低活細胞移植的免疫排斥、栓塞和成瘤等風險；同時，干細胞的高增殖力又能保證獲取足量的滿足研究所需的外泌體。由此可見，干細胞來源的外泌體極富研究潛力和應用價值。

2 MenSC-Ex 的研究背景

間充質干細胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一種多能干細胞，具有干細胞的基本生物學特性，即自我更新和多向分化潛能[5]。目前，MSC 多是從骨髓、脂肪、臍帶和胎盤等組織中獲得，其中對于骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cell，bM-MSC）的研究最為深入。在與MSC 相關的“無細胞”治療中，bM-MSC 來源外泌體（bone marrow mesenchymal stem cell-derived exosomes，bM-MSC-Ex）亦備受關注。如利用bM-MSC-Ex調節衰老相關胰島素抵抗[6]、促進骨折恢復和成骨細胞分化[7]等，在重癥新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的治療中bM-MSC-Ex也表現出積極的作用[8]。然而，獲取bM-MSC 的有創過程制約了其廣泛應用。2007 年，Meng 等[9]在人類月經血中發現了一類具有干細胞特征的細胞群，稱之為月經血干細胞（menstrual blood stem cell，MenSC）。后續研究發現，與骨髓或其他來源的干細胞相比，MenSC 不但取材過程簡單、無創，應用不存在倫理問題，而且在合成、分泌細胞因子等方面亦具有顯著優勢[10]。那么，作為一種易于獲得、具有高度增殖能力的干細胞，MenSC 是否有可能成為高效的供體細胞，為科學研究及治療提供優質且性狀穩定的外泌體呢？

MenSC-Ex 攜帶了其來源細胞——MenSC 的豐富的遺傳信息，并對這些信息進行了高效富集，能夠調控包括凋亡、炎癥和免疫在內的多種生物過程，靶向發揮作用。對于MenSC-Ex 對多種疾病的探索性研究發現，除了極有可能成為一種新型干預手段以外，其特殊的納米級脂質雙分子層結構亦使其極富潛力成為一種新型藥物載體，在“無細胞”和精準靶向治療上發揮積極的作用。

3 MenSC-Ex 的應用

3.1 MenSC-Ex 與組織再生MSC 來源的外泌體能夠通過抑制外周血單個核細胞的增殖，降低細胞凋亡和炎癥反應，促進內源性神經元的生長和突觸連接[11]。比較不同來源的MSC 所分泌的外泌體對神經元生長的作用后發現，MenSC-Ex 對背根神經節神經元突起生長的影響與bM-MSC-Ex 相當，而對皮層神經元最長軸突生長的促進作用優于bM-MSCEx[12]?？梢姡琈enSC-Ex 對大腦皮層神經突起的生長具有更好的促進效果。這一研究對于治療神經系統疾病的MSC 及其衍生物的選擇具有重要指導意義。

特發性肺纖維化好發于中老年人群，是一種以肺組織不可逆纖維化為特征的慢性進展性疾病。該病預后差、病死率高，在美國65 歲及以上人群中，中位生存期僅為2～3 年[13]。已有研究發現MenSC 能夠通過抑制免疫和抗纖維化作用逆轉急性肺損傷[14]。Sun 等[15]發現，在大鼠特發性肺纖維化模型中，從月經血中獲得的外泌體能夠顯著改善博萊霉素（Bleomycin，BLM）介導的肺纖維化和肺泡上皮損傷。介導這一調控過程的關鍵元件是MenSC-Ex 所攜帶的miRNA let-7。通過靶向LOX1調節NLRP3 信號，let-7 能夠阻斷活性氧（reactive oxygen species，ROS）的活化，減少DNA 損傷和細胞凋亡，同時抑制炎癥反應的激活。這些發現為研究MenSC-Ex 在特發性肺纖維化臨床治療中的應用奠定了基礎。

1 型糖尿病是由免疫介導的胰島β 細胞團丟失所導致的胰島素終身依賴性疾病，調控免疫反應可能是其治療的關鍵。已有研究發現MSC 能夠通過抑制自身免疫促進胰島細胞再生[5]，然而，這一治療方法亦存在干細胞治療的普遍安全問題。為了規避安全隱患，Mahdipour 等[16]應用從月經血中分離的外泌體對1 型糖尿病進行干預。在體外和體內實驗中發現，MenSC-Ex 能夠恢復β 細胞團的再生并促進胰島素的合成，在接受MenSC-Ex 治療后，胰腺十二指腸同源盒1（pancreatic and duodenal homeobox 1，PDX-1）表達量明顯增加，而Pdx-1 是具有促進β 細胞再生、成熟和胰島素合成作用的重要細胞因子。

3.2 MenSC-Ex 與組織修復傷口愈合是涉及多種機制的復雜過程。近年來，“細胞療法”在皮膚組織修復的研究中備受青睞，已有多種細胞被應用于臨床試驗，而MSC 來源的外泌體因具有免疫調節和再生功能亦備受關注[17]。糖尿病患者體內存在多重病理機制干擾創傷愈合，因此，這一人群的傷口愈合成為創傷修復領域亟待解決的難題。Dalirfardouei 等[18]研究發現，MenSC-Ex 能夠通過旁分泌途徑促進糖尿病小鼠的傷口愈合。應用鏈脲佐菌素在糖尿病小鼠背部構建皮膚全層損傷模型，外源性MenSC-Ex通過誘導巨噬細胞的M1-M2 極化改善了炎癥狀態，并通過降低Col1/Col3 比值減少瘢痕形成，進而促進傷口愈合過程，改善愈合結局。

暴發性肝功能衰竭（fulminant hepatic failure，FHF）是一種急危重癥，起病急、進展迅速且死亡率高。一項關于FHF 的研究發現，在接受MenSC-Ex 移植后，包括細胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管生成素（angiogenin，ANG）、白細胞介素6（Interleukin-6，IL-6）等在內的多種修復性因子均呈高表達[19]。在小鼠FHF 模型體內，靜脈注入的MenSC-Ex 能夠遷移至肝臟，靶向作用于損傷的肝細胞，使得單核細胞數量減少、活性凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase3）表達下調，進而修復損傷、改善肝功能和提高存活率。這一研究證實了MenSC-Ex 的抗凋亡作用，使應用MenSC-Ex修復FHF 成為可能；同時亦揭示了MenSC-Ex 的“靶向”工作機制，顯示出外泌體精準治療的優勢。

宮腔粘連（intrauterine adhesion，IUA）是由于子宮內膜基底層損傷而導致的宮腔內粘連，表現為月經量減少甚至閉經，最終導致不孕[20]。IUA 治療手段有限、復發率高，是棘手的臨床問題。Saribas 等[21]應用與MenSC 特征相似的子宮內膜MSC 對IUA 進行了干預性研究。在接受了從子宮內膜MSC 中獲得的外泌體治療后，組織內基質金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和MMP-9 表達顯著上調，促進子宮內膜細胞增殖和局部血管再生，同時降低纖維化，發揮了積極的修復作用。該研究同時發現，子宮內膜MSC-Ex 對IUA 的修復效果明顯優于子宮內膜MSC，提示外泌體對子宮內膜MSC 內的生物信息進行了富集，因此治療作用更為高效。

3.3 MenSC-Ex 與腫瘤血管生成是腫瘤發生、發展的重要過程，因此抗血管生成是當前腫瘤靶向治療的主要途徑之一[22]。外泌體多通過血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）相關通路實現對腫瘤血管生成的調控[23]。Alcayaga-Miranda等[24]發現，MenSC-Ex 能夠降低前列腺癌細胞內ROS的合成，進而作用于核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和VEGF 通路，抑制VEGF、缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）等ROS 依賴性促血管生成因子的合成，從而抑制腫瘤血管生成、控制腫瘤生長。此項研究同時發現，bM-MSC-Ex對前列腺癌細胞的血管生成呈現促進作用，表現為促血管生成因子的高表達。Rosenberger 等[25]發現，在倉鼠頰囊癌（口腔鱗狀細胞癌）模型中，MenSC-Ex 能夠抑制腫瘤細胞的VEGF 分泌，并對內皮細胞產生細胞毒性作用，誘導內皮細胞凋亡，從而干預腫瘤脈管系統的重建，抑制腫瘤生長。由此可見，MenSC-Ex的抗血管生成作用，可能賦予其獨特的潛力，為腫瘤的抗血管生成治療開辟新的路徑。

3.4 MenSC-Ex 與生殖不孕癥是持續存在并越發引起學者關注的全球性生殖問題，如何提高體外受精-胚胎移植的成功率、改善輔助生殖的妊娠結局一直是研究熱點所在。Blázquez 等[26]發現，子宮內膜MSC 分泌的外泌體能夠使體外培養的囊胚總細胞數增加，提高胚胎血管生成因子A 的分泌，進而促進子宮內膜血管生成和組織重塑，改善體外受精的妊娠結局。該研究證實了子宮內膜MSC 分泌的外泌體對胚胎發育的促進作用，為其在生殖醫學領域的研究和應用奠定了基礎。

早發性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是影響女性生育力的主要原因之一，只有約5%的患者可能由于疾病自然緩解而獲得妊娠。當前，恢復卵巢儲備和激活休眠卵泡是POI 治療的常用策略，而不同來源的干細胞亦是可能的治療選擇[27]。Zhang 等[28]研究發現MenSC-Ex 對POI 表現出積極的干預作用：體外培養的SD 大鼠卵巢在接受MenSC-Ex 治療后，始基卵泡和初級卵泡中的顆粒細胞明顯增殖，同時卵泡凋亡明顯受到抑制。在由四乙烯基環己烯二環氧化物誘導構建的POI 大鼠模型中，MenSCs-Ex 有效逆轉了藥物毒性導致的卵巢功能不全，表現為顯著促進卵泡發育，恢復體內激素水平；同時，調控卵巢細胞外基質構成，加速休眠卵泡的募集，進而促進顆粒細胞的增殖，改善妊娠結局。研究同時發現，多次應用MenSC-Ex 全身治療的效果與卵泡內MenSC 移植相當，這也為利用無細胞生物資源恢復卵巢功能提供了重要理論依據。

4 結語與展望

MenSC-Ex 憑借著取材過程簡單無創、細胞來源豐富、應用不存在倫理問題等諸多優勢，受到研究者的廣泛關注并已在組織再生與修復、腫瘤和生殖醫學等領域取得了一定的研究進展。然而在逐步深入地對MenSC-Ex 展開研究直至引入臨床治療的過程中，仍存在諸多問題有待解決。例如，當前外泌體的提取效率較低，如何優化方法、提高效率，是保證研究所需外泌體的關鍵。對于MenSC-Ex 的具體工作機制，尚缺乏系統性的深入研究。明確MenSC-Ex 與MenSC 在遺傳信息上的差異，是進一步了解MenSC-Ex 的功能并挖掘其治療作用的重要基礎。此外，體外研究的可重復性和體內研究的安全性尚需大量研究進一步論證。

前期研究顯示，MenSC-Ex 對多種疾病表現出積極的干預作用，對于其治療價值的挖掘有待更多的研究探索。而除了通過介導細胞間通訊調控靶細胞的生物學功能以外，外泌體特定的分子質量和天然的納米脂質雙分子層結構亦使得其有可能成為高效的納米顆粒遞送系統，承載藥物及生物分子通過人體生物屏障，靶向發揮治療作用[29]。已有研究發掘了多種其他細胞來源的外泌體作為藥物載體的可能性[30-31]，而無創來源的MenSC-Ex 是否更具優勢，值得進一步探索。在“無創”和“精準”的醫療研究理念指引下，隨著研究的逐步深入，定能挖掘出MenSCEx 更多的研究潛能和實用價值，使其在“無細胞”治療中發揮更大的作用。