微小RNA 在子宮內膜異位癥中的研究進展

曹敏，張廣美

子宮內膜異位癥（endometriosis，EMs）是育齡期女性最常見的婦科疾病之一，據估計EMs 在育齡期婦女中發病率為10%～15%[1]，其特征為有活性的子宮內膜組織（腺體或間質）種植于子宮腔以外的部位，臨床上通常表現為疼痛、不孕、性交不適、月經異常、消化系統及泌尿系統異常等癥狀，雖為良性疾病卻在行為學上表現為惡性生物學特征。盡管有幾種假說試圖解釋EMs 的發生原因，但根本機制仍不清晰，并不能解釋90%的女性存在經血逆流現象而僅有10%左右發展為EMs，預示著EMs 的發生、發展過程中可能存在著其他調控機制。最近，微小RNA（microRNA，miRNA）在EMs 的發病機制中起到的作用日益引起重視。miRNA 是一類長約22 個堿基的內源性非編碼RNA 分子，通過不完全堿基互補的方式與靶基因mRNA 的3′非編碼區（3′untranslated region，3′UTR）結合，完成對靶基因mRNA 的抑制、關閉，進而實現對基因的負調控作用[2]。有研究檢測到EMs 患者的在位內膜、異位內膜、血清中miRNA的表達與正常女性均存在差異，現就miRNA 與EMs的病理生理學研究新進展進行綜述。

1 miRNA調節細胞的增殖和凋亡

細胞的增殖與凋亡受多種基因的復雜調節，任何一方失控都能導致機體功能障礙和疾病發生，異常增殖及凋亡抑制是EMs 異位病灶在盆腔內存活甚至發生遠處轉移的重要因素，以下miRNA 均有可能參與這些基因的調控與表達。

1.1 miR-503Hirakawa 等[3]通過結合亞硫酸氫鈉變性的限制性酶分析（combined bisulfite restriction analysis，COBRA）發現，子宮內膜異位囊腫基質細胞（endometriotic cyst stromal cells，ECSCs）受到DNA 超甲基化影響而出現miR-503 表達下降。將miR-503轉染到ECSCs 中，發現miR-503 可通過抑制細胞周期蛋白D1 并誘導G0/G1 期的細胞周期停滯抑制細胞增殖，通過抑制B 細胞淋巴瘤2（Bcl-2）基因促進細胞凋亡。Bcl-2 是在子宮內膜和基質均表達的一種原癌基因，具有重要的抑制凋亡作用。文曉鳳等[4]用免疫組織化學法發現Bcl-2 表達水平在子宮內膜增殖期增加，在分泌期降低，異位內膜組織較正常內膜組織中的Bcl-2 表達明顯增加，這些差異性表達為異位內膜組織中miR-503 低表達致Bcl-2 水平升高而抑制凋亡的猜想提供了依據。Taghavipour 等[5]認為Bcl-2 的這種抑制凋亡作用主要通過抑制促凋亡蛋白[如Bcl 相關的X 蛋白（Bax）、Bcl 樣蛋白（Bcl-X）和Bcl-2 同源拮抗物（Bak）等]發揮作用。Lai 等[6]通過電子自旋共振（electron spin resonance，ESR）技術證實了Bax 在促進凋亡方面的重要性，當細胞受到各種因素刺激后，Bax 等在凋亡過程中被激活，從胞質溶膠轉移到線粒體外膜并寡聚，使線粒體外膜發生實質性結構變化，實現線粒體外膜透化（mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP），使線粒體釋放的凋亡因子通過而觸發凋亡。

1.2 其他miRNA研究證實多種miRNA 參與異位子宮內膜細胞增殖，并在EMs 患者中差異表達。Zhao 等[7]發現與正常子宮內膜相比，EMs 異位內膜中孤兒核受體/miR-181c/哺乳動物STE20 樣激酶1（NR4A/miR-181c/Mst1）信號通路發揮著重要作用，異位內膜組織中NR4A/miR-181c 高表達，Mst1 表達量顯著下調，其中Mst1 具有增強線粒體分裂蛋白Drp1 轉錄后Ser616 位點磷酸化、通過p53 抑制Parkin 基因轉錄活化和啟動半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9（Capase9）等作用，激活線粒體分裂和抑制自噬，推測該通路抑制了異位內膜細胞凋亡。Hu 等[8]發現用miR-370-3p 模擬物轉染原發性子宮內膜異位細胞會導致類固醇生成因子1（steroidogenic factor-1，SF-1）和其下游靶基因類固醇生成急性調節蛋白（StAR）和芳香化酶（CYP19A1）的表達改變，促進異位內膜組織凋亡，證實EMs 患者血清中miR-370-3p 水平降低而EMs 病變中SF-1 mRNA 水平上調，可促進異位內膜細胞增殖并抑制其凋亡。

2 miRNA 與細胞黏附及侵襲

脫落的子宮內膜細胞需經過三重防線進入腹腔，然后在腹膜、盆腔臟器，甚至腎、腦等遠處器官植入并產生功能損害，這與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）防御作用減弱、異位內膜細胞黏附侵襲能力增強密切相關。

2.1 核因子κB（NF-κB）Wu 等[9]證實外源性miR-199a 可在子宮內膜間質細胞中靶向抑制NF-κB 激活所需輔因子IκB 激酶β（IKKB），從而抑制NF-κB 活化。多項研究證實miR-199a 在異位子宮內膜細胞中表達減少，對NF-κB 的抑制活化作用減弱，影響細胞因子的表達，如白細胞介素10（IL-10）過表達并激活基質金屬蛋白酶（MMP），導致ECM 過度降解，促進子宮內膜基質細胞的侵襲，證實miR-199a 低表達可使異位子宮內膜間充質干細胞（EN-MSCs）在體內外均具有較高的細胞侵襲能力[10]。Zheng 等[11]證明異位內膜組織中高表達的miR-9-5p 通過NF-κB 通路靶向沉默信息調節因子1（SIRT1）的表達，促進子宮內膜間質細胞的侵襲和遷移，通過試驗性調整miR-9-5p 的表達量，進一步發現子宮內膜間質細胞遷移的距離以及進入Transwell小室下腔的細胞數量與之呈正相關，從而證明了miRNA 在促進異位內膜細胞黏附與侵襲方面的作用。

2.2 其他miRNA異位內膜黏附種植于腹腔臟器，并完成侵襲及遠處轉移是EMs 重要的惡性特征性表現，是復發的重要病理學基礎，很多miRNA 發揮了不可忽視的作用。Wang 等[12]通過體外實驗證實，環狀RNA circATRNL1 過表達可促進內膜細胞的遷移和侵襲，并誘導異位病灶形成，而circATRNL1 的沉默則表現出相反的作用，并進一步解釋其原因為高水平表達的circATRNL1 負向調控miR-141-3p 和miR-200a-3p，使其共同的下游靶基因yes 相關蛋白1（yes-associated protein 1，YAP1）過表達，促進異位內膜細胞的黏附與侵襲。Mai 等[13]研究發現，miR-506-5p 在異位內膜組織中高表達并通過抑制WNT 抑制因子1（WNT inhibitory factor 1，WIF1）表達激活Wnt/β-連環蛋白（β-catenin）途徑，β-catenin 是轉錄因子家族的協同激活因子，與其結合后可啟動下游靶基因的轉錄，促進細胞的增殖從而誘導異位內膜細胞的遷移和侵襲。

3 miRNA 與血管生成

EMs 發病機制尚未明確，多數學者認為新生血管生成在脫落子宮內膜的異位定植過程中發揮重要作用，近年來發現多種miRNA 可以調控血管生成。

3.1 血管內皮生長因子（VEGF）VEGF 是一種高度特異性的血管內皮細胞有絲分裂素，具有增加血管通透性，促進血管內皮細胞遷移、增殖和血管生成等作用，其中VEGFA 為主要發揮生物學作用的一個最關鍵亞型。Chamorro-Jorganes 等[14]用細胞轉染技術證明miR-16-5p 和miR-424-5p 直接靶向VEGF、VEGF 受體2（VEGFR-2）和成纖維細胞生長因子受體1（FGFR-1），使模擬轉染后VEGF、VEGFR-2 和FGFR-1 的表達顯著降低，而這些miRNA 的拮抗劑則表現為相反作用，由此推測這兩種miRNA 在異位內膜中的低表達促進內皮細胞血管生成。俞田田等[15]用微小RNA 陣列（miRNA array）芯片檢測孕早期妊娠丟失患者蛻膜組織中差異表達的miRNA，發現miR-125a-5p 和miR-29c-3p 差異性表達上調最為明顯，進一步應用靶基因技術推定兩者均通過對VEGFA 的調控影響子宮內膜蛻膜化血管重塑的過程，參與流產發生。Ma 等[16]通過研究證實子宮內膜異位組織中miR-200b、miR-15a-5p和miR-142-3p 的表達降低，其中miR-142-3p 直接靶 向Krüppel樣因子9（KLF9），KLF9可直接與VEGFA 基因的啟動子結合，使VEGFA 表達水平升高，腹腔注射miR-142-3p 慢病毒或敲除KLF9 均可顯著抑制新生血管形成，因此，miR-142-3p/KLF9/VEGFA 信號通路可能是減少EMs 患者新生血管形成的潛在治療靶點。

3.2 血管生成素1（angiopoietin-1，Ang-1）劉敏娟等[17]通過芯片測序發現miR-96 在EMs 患者的子宮內膜中高表達，且miR-96 可特異性靶向Ang-1 基因的3′UTR 區，促進Ang-1 的表達，促進血管的重塑、成熟及穩定。據此推測miRNA 可作用于多種靶點，促進子宮內膜異位病灶的血管生成與植入。

4 miRNA 與免疫和炎癥

研究發現EMs 患者腹腔內可檢測到多種類型的免疫細胞，形成了復雜的炎癥性微環境，這種微環境有利于內膜細胞的種植與EMs 病灶的形成；EMs病灶切除術后，腹腔內炎癥狀態可明顯改善，這為EMs 病灶促進炎癥因子分泌的猜想提供了證據。

4.1 炎癥促進EMs 發展微環境中長期存在的慢性炎癥會誘導免疫抑制細胞積累，出現T 細胞質量受損表現，如輔助性T 細胞1/輔助性T 細胞2（Th1/Th2）失衡、CD4+T 細胞生成一氧化氮（NO）增加，T 細胞受體（T cell receptor，TCR）z 鏈水平降低，促進EMs炎癥的發生和疾病的進展[18]。Chen 等[19]研究表明炎性細胞因子和外泌體miRNA 可能與EMs 的發展關系密切，普遍認為外泌體miRNA 是炎癥和T 細胞免疫反應的介體，晚期EMs 患者腹腔液中可檢測到多種外泌體miRNA 表達改變、調節性T 細胞（Treg）擴增，其中miR-451a 上調尤為顯著，這些外泌體可能導致腹腔內炎癥環境的形成與免疫異常，為EMs 病灶的定植與血管生成提供了可能。

4.2 EMs 異位病灶促進炎癥發生EMs 異位病灶直接或間接地改變了患者的腹腔內微環境。有學者證實EMs 患者的腹腔液和腹腔內CD14 單核細胞/巨噬細胞中miR-146b 的表達增加，miR-146b 通過減弱干擾素調節因子5（interferon regulatory factor 5，IRF5）表達參與了炎癥的負調控[20]。Tang 等[21]發現miR-455 在EMs 患者的異位內膜組織中低表達是腹腔內炎癥損害的重要原因，并進一步推定其是脂肪酸結合蛋白4（fatty acid binding protein 4，FABP4）的靶向miRNA，并進一步證實miR-455 可以成功結合FABP4 的3′UTR 保護子宮內膜基質細胞免受過氧化氫（H2O2）引起的損害。

5 miRNA 與不孕

EMs 患者不孕原因與子宮內膜容受性降低、免疫異常等原因密切相關，應著眼于多種因素尋找突破點提高患者妊娠率[22]。眾多學者通過研究人體組織與小鼠模型證實EMs 患者的分子標志物已發生改變，多種miRNA 參與妊娠調節。

5.1 容受性降低子宮內膜容受性是指子宮內膜對植入胚胎的接受能力，只出現于每個月經周期中的特殊時期，是一種綜合性狀態，其中包括子宮內膜厚度、形態以及血流分布等，受多種因素復雜調控。Petracco 等[23]認為miR-135a/b 的表達與子宮內膜容受性有關，分泌期子宮內膜miR-135a/b 的表達水平比增殖期高，EMs 患者miR-135a/b 的表達水平比正常育齡期女性少。由此可推測其在生殖組織的穩態中起正向決定性作用。但另有研究證實，EMs 相關性不孕婦女著床窗口期原位子宮內膜組織中5 個差異表達的miRNA（miR-142-5p、miR-146a-5p、miR-1281、miR-940 和miR-4634）顯著上調，而miR-543顯著下調，從而猜測這些miRNA 的表達改變可能會影響胚胎植入[24]。這些miRNA 的表達異常均有可能影響子宮內膜功能，損害胚胎植入從而導致EMs 相關性不孕的發生。

5.2 孕酮抵抗多數EMs 患者對孕酮治療呈現低反應或無反應，稱之為孕酮抵抗。Pei 等[25]發現miR-194-3p 在輕度EMs 患者的子宮內膜組織中過表達，其通過促進細胞形態學變化和調整催乳素水平來抑制胚胎干細胞的體外蛻膜化。進一步研究證實miR-194-3p 導致EMs 患者孕酮抵抗是通過抑制孕激素受體（progesterone receptor，PGR）的水平和在位子宮內膜中的蛻膜化來阻礙生育。Zhou 等[26]認為miR-196a 過表達同樣可導致孕酮抵抗，EMs 患者內膜組織中miR-196a 水平顯著上升，其通過上調細胞外調節蛋白激酶激酶/細胞外調節蛋白激酶（MEK/ERK）信號通路與抑制PGR 表達來阻礙子宮內膜蛻膜化，導致EMs 患者妊娠率下降。

6 miRNA 與EMs 的治療

目前EMs 發病機制尚不清晰，缺乏特異性診斷標志物，診斷主要依靠于腹腔鏡，所以存在著延遲診斷以及延誤治療，其雖為良性疾病卻嚴重影響婦女的健康與生活質量。目前EMs 的治療方式主要為手術治療，miRNA 治療仍缺乏臨床證據，但很多學者從此方面提供了思路，為臨床診斷與治療提供了更為廣闊的思路。

Li 等[27]通過3′UTR 熒光素酶的報告基因測定結果推測miR-92a 轉染后的高表達可降低第10 號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten gene，PTEN 基因）水平，使基質細胞對孕酮治療更具抵抗力。另一方面使用miRNA 拮抗劑（antagomir）抑制miR-92a 的作用可增強孕酮的治療效果，抑制基質細胞增殖，并減少EMs 小鼠模型中異位病灶的形成。另有學者證實miR-200c 受轉移相關肺腺癌轉錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）的負向調控，抑制人子宮內膜基質細胞的增殖和遷移，局部注射miR-200c 模擬物或行MALAT1 敲除均可顯著抑制異位子宮內膜病變的生長[28]。Park 等[29]發現EMs 患者子宮內膜中miR-21-5p 的表達明顯上調，用皂苷提取物處理人子宮內膜基質細胞后miR-21-5p 的表達下降導致Caspase3的表達顯著增加，進而促進了內膜細胞的凋亡。由此推測，皂苷提取物可能通過調節特定的miRNA 來治療EMs。

7 結語

miRNA 與EMs 具體的發病機制之間的關系尚未得到準確充分的認識，全面分析EMs 的發病機制可對臨床不孕患者的治療起到指導作用。miRNA 之間的關系錯綜復雜，一種miRNA 可能作用于多種信號通路、靶位點，一種靶位點可能受多種miRNA調控，這種復雜的網狀通路的形成促進了EMs 的發生、進展。單從某一個方面著手進行治療，往往得不到預想的結局。EMs 至今無法根治，對患者生活質量造成的不良影響也缺乏有效的干預手段，目前臨床醫生應著眼于多種復雜性機制網，根據不同情況采取個體化治療措施、長期管理、對癥治療，改善患者生活質量，提高患者妊娠率。