基于香氣物質進行烏龍茶核心種質構建與遺傳評估

孔祥瑞，楊 軍，林梓溪，馬定國，王讓劍*，陳常頌*

(1.福建省農業科學院茶葉研究所，福建 福州 350013；2.國家茶葉質量安全工程技術研究中心，福建 安溪 362441；3.福安市碧海藍天農業科技發展有限公司，福建 福安 355000)

核心種質作為種質資源少而精的縮影性群體，是遺傳理論研究和育種親本選配的重要基礎[1]。因此，核心種質構建長期以來始終是植物育種研究的熱點和焦點[2-3]。以水稻、小麥、玉米、大豆、棉花、油菜等為代表的大宗作物[4-8]和以樟木、木荷等為代表的木本經濟作物[9-11]，都取得了一系列突破性進展。同時，在取樣策略、評價指數、分析流程等方面積累了很多值得借鑒的技術[12-18]。

茶樹作為南方山區的重要經濟作物，核心種質構建也有相關文獻可供查閱[19-25]，但專門針對烏龍茶的核心種質構建的研究卻鮮有報道。從上個世紀五六十年代開始，烏龍茶育種研究方向正式確立[26,27]，經過近70年的發展，在品種和資源數量上有了很大的積累。截至目前，我國被收集保存的烏龍茶品種和名貴單樅總數80余個，占我國茶樹品種總數20%以上[28]。Lin等[29]研究發現，烏龍茶品種群體內具有較高的遺傳多樣性。不斷增長的資源(含品種)數量和豐富的遺傳多樣性，為開展烏龍茶核心種質構建提供了客觀條件。

烏龍茶有別于其他茶類最顯著的特征是具有自然優雅的花果香，本研究選擇鐵觀音、黃棪、茗科1號(金觀音)等12個在生產應用上綜合性狀表現優異，極具高香特征的烏龍茶品種，以揮發性香氣物質為表型性狀，嘗試構建烏龍茶核心種質篩選技術流程，并結合SSR標記，對篩選前后2個種群的遺傳多樣性進行比較分析，從而全面評價整套分析流程的可行性。以期為烏龍茶核心種質篩選評價和烏龍茶雜交育種親本選配提供理論與技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇福建省福安市碧海藍天農業科技發展有限公司福安基地的12個茶樹品種(種質)為試驗材料(表1)，均為3齡期無性系植株，田間管理屬同一立地條件隨機區組種植。2020年10月，以一芽三葉為標準，用液氮取樣，每個品種設3次實驗重復。

表1 12個供試品種(種質)基本情況

1.2 香氣組分測定

樣品預處理參照李麗霞等[30]的方法，取1.0 g冷凍干燥樣，加入3.2 g NaCl和5 mL 60℃超純水，加蓋密封后在60℃條件下水浴10 min，再經固相微萃取50 min和進樣口230℃高溫解析共5 min，-20℃密封保存、待測。

色譜條件：美國Agilent公司DB-5(3 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱箱：40℃；進樣口溫度：230℃；載氣：氦氣；采用不分流進樣；流速：1.0 mL·min-1。升溫程序：先40℃保持2 min，以5℃·min-1升溫至85℃保持2 min，再以2℃·min-1升溫至110℃保持2 min，最后以7℃·min-1升溫至220℃保持8 min，總分析時間為123.5 min。

質譜條件：EI電離能量：70 eV；掃描范圍為質荷比(m/z)35～400；離子源溫度：230℃。

香氣物質的定性與定量：對獲得的揮發性成分總離子色譜圖，通過檢索mainlib、replib和nist_ri譜庫完成定性；依據峰面積歸一化進行定量。并與相關文獻研究結果比較[31-33]，完成最終確認。

1.3 核心種質構建

核心種質構建通過QGAStation實現[34]，抽樣比率設置為0.25，抽樣方法選多次聚類隨機取樣法，遺傳距離選馬氏距離。

1.4 遺傳多樣性分析

DNA提取和SSR分析參考王讓劍等[35]的方法。群體間遺傳距離及遺傳多樣性指數等通過軟件Powermarker計算[36]，其中基因型bp轉0、1數據通過軟件DataFormater完成[37]。個體遺傳結構組成分析由R語言LEA軟件包實現[38]，其他相關數據統計分析及圖表繪制也均由R語言的ggplot2、export等包完成[39]。

2 結果與分析

2.1 香氣組分的GC-MS分析

經SPME-GC-MS獲得香氣組分之后，在控制同一香氣物質在不同品種間的保留時間≤0.1 min的條件下，可分離鑒定出的香氣主要成分見表2。

表2 12個烏龍茶品種GC-MS分離主要香氣成分相對含量

2.2 核心香氣組分篩選

因為核心種質的分析過程需要構建非等長矩陣，即性狀值必須少于品種數，所以，對上述30個香氣物質進行核心成分篩選分析，通過軟件QGAStation，將抽樣比率設置為0.25，在多次隨機抽樣之后，根據核心香氣成分與原總香氣成分2個種群之間的差異統計分析，在均值未達到差異顯著性水平和極差、變異系數變化趨勢一致的情況下，獲得橙花叔醇、芳樟醇、香葉醇等7個香氣成分，初步將其作為典型表型性狀供核心種質篩選使用，差異統計分析結果見表3。

表3 核心香氣成分與原香氣成分之間差異分析結果

2.3 核心種質構建

在篩選獲得核心香氣組分的條件下，同樣使用軟件QGAStation，將抽樣比率設置為0.25，以多次聚類隨機取樣法進行烏龍茶核心種質篩選，其中遺傳距離選用馬氏距離。結果表明，基于核心香氣組分，12個供試品種中可以篩選獲得3個核心種質，分別是金牡丹、鐵觀音和悅茗香。這3個品種構建的核心種質與包括12個品種的原種質種群相比，在各個核心香氣組分表型上的差異統計分析見表4。核心種質與原始種質之間，除芳樟醇氧化物I的方差呈現P<0.05顯著差異之外，其他所有性狀的均值、方差差異百分率都為0，即無顯著性差異。此外，核心種質與原始種質間在7個核心香氣表型上的極差和變異系數高度對應，極差符合率為67.97，變異系數變化率為105.27，綜合多個統計參數，證明篩選出的核心種質對供試群體具有較好的表征力。

表4 核心種質與原種質間表型差異

2.4 核心種質遺傳評估

2.4.1 遺傳多樣性分析 為了進一步考察整個核心種質構建流程的可靠性，本研究對所有參試品種進行了40對SSR引物的基因型分型分析，在12份供試材料上共檢測到161個多態性位點，涉及200個等位變異，平均等位變異數為4.03，多態性信息含量(PIC)均值為0.50，說明這40對引物適合揭示該群體的遺傳多樣性。通過計算遺傳多樣性指數，發現核心種質種群的多樣性指數變幅為0.08～0.77，可以完全涵蓋原始群體的均值0.55水平，且2個種群間的遺傳距離為0.133，從而在遺傳水平上進一步證實了核心種質具有很好的群體表征力。

2.4.2 遺傳背景分析 借鑒群體遺傳學中常用的群體結構分析，采用LEA軟件包的Structure功能來深入考察核心種質個體遺傳背景的代表性，參照Evanno等的方法[40]，在K值等于3時，ΔK出現最大值拐點，因此將該供試群體暫定分為3個亞群來繪制Structure圖。結果顯示(圖1)，金牡丹、鐵觀音和悅茗香在個體遺傳組成上具有高水平的亞群代表性，更進一步證實了這3份材料被篩選成為核心種質的合理性。

圖1 12份烏龍茶品種的群體結構圖

3 討論與結論

3.1 核心種質構建分析流程

核心種質構建作為動植物資源育種的核心研究內容，從最初的單純依照表型篩選，到現在的多組學聯合分析，呈現出了解析力度大、精度高的發展趨勢，同時也對相應抽樣策略和評估算法提出了更高的要求。本研究采用的抽樣和評估方法均為當前的主流算法，根據分析結果來看，在以代謝物作為表型，應用多次聚類隨機取樣法可以滿足烏龍茶核心種質篩選需求，并通過標記基因型解析方法輔以驗證，進一步保證了分析結果的正確率。理論上，該分析流程也應該能夠滿足以其他表型值為目標性狀的篩選需求。故此，穩健的烏龍茶核心種質構建分析流程可由極具擴展度的表型值、取樣算法和遺傳評估組成(圖2)。

圖2 烏龍茶核心種質篩選分析流程

3.2 小樣本抽樣表型值的取舍

在高通量測試技術不斷發展的前提下，試驗數據的性狀觀察值多于供試材料樣本數的情況十分常見，使得很多算法因無法構建合理矩陣而限制其應用，通常的做法是應用主成分分析、均值聚類等各種算法進行數據降維，之后再用降維后的觀測值來做后續分析。這類處理方法需要耗費大量的計算資源，而且實驗效果也無從保證。本實驗嘗試應用原始數據倒置的處理方法，對性狀值進行降維處理，分析結果與預期是完全吻合的。當將這些篩選出的核心性狀在核心種質與原生種質2個種群進行小樣本非參數差異統計檢驗時，7個表型在2個種群間無顯著性差異，且P值0.39～1(圖3)，從而逆向證明了倒置處理針對小樣本進行表型值取舍的可行性。更肯定了該分析流程也可以應用于小樣本群體的核心種質構建。

圖3 非參數統計分析在2個種群間的差異檢驗結果

此外，通過該流程分析獲得的核心表型值與宛曉春等[41]提到的烏龍茶香氣物質主要成分相一致，即橙花叔醇對應木香，芳樟醇及其氧化物對應鈴蘭的清爽性花香，香葉醇對應薔薇的溫暖性花香。所以，今后相關研究可以將這7個香氣成分作為烏龍茶呈香重要指標加以利用。理論上，選出的3個核心種質可以作為烏龍茶品種香氣改良的優選親本加以使用，但由于測試材料數量有限，3個核心種質的實際育種價值還有待深入研究。

就試驗結果來看，這套技術流程完全可以滿足烏龍茶核心種質構建分析，而且對表型值有較為寬泛的涵蓋域。此外，對于小樣本高通量表型數據也有相應的解決策略，使其在實際應用中具有更大的靈活性。再加上高通量測序技術的不斷發展和大范圍普及，該流程的基于遺傳信息驗證功能也將使整個分析流程具有更高的穩健性和糾錯率，能夠多層面確保篩選獲得的核心種質具有較高的表征力。