茶樹COBRA基因家族全基因組鑒定及表達分析

艾安濤，李燕麗,2，章文益，呂立堂,3*

(1.貴州大學茶學院，貴州 貴陽 550025；2.湄潭縣茶產業發展中心，貴州 湄潭 564100；3.貴州大學農業生物工程研究院/生命科學學院，山地植物資源保護與種質創新省部共建教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

茶樹(Camelliasinensis(L.)O.Ktze.)是我國重要的經濟作物之一，在“十三五”期間為脫貧攻堅做出了極大的貢獻，“十四五”更將起著重要的作用。

茶樹的生長發育，會受到干旱、高低溫等不同的逆境脅迫，COBRA基因在茶樹的生長發育和逆境響應中有著很重要的作用。COBRA基因是由Schindelman[1]在研究擬南芥的根發育時發現的，經研究COBRA基因作為一類GPI錨定蛋白，主要作用于細胞伸長、纖維素沉積的過程[2]，COBRA蛋白的結構極為保守，主要包含 N 端信號肽、碳水化合物結合域、富含半胱氨酸的 CCVS 結構域和C末端 GPI(Glycosyl phosphatidyl inositol)蛋白的ω-位點[3]。COBRA基因對由根、莖、葉和其他營養器官的結構組織組成的細胞壁成分的生物合成至關重要[4]。李家洋[5]對COBRA編碼蛋白BC1進行克隆鑒定，結果表明BC1基因通過降低細胞壁厚度和增加纖維素含量，在機械組織細胞壁的生物合成中起著重要的作用；在擬南芥中研究發現AtCOBL4參與次生細胞壁纖維素合成[6]，AtCOBL9與根毛發育有關[7]，以上研究結果表明COBRA基因廣泛存在于植物中，并且與植物細胞壁、纖維素等有關。

目前為止，在高粱、亞麻、冬棗、毛果楊中鑒定出COBRA基因的家族成員，分別有10、24、10、14個。自茶樹全基因組測序完成之后，關于茶樹基因家族的鑒定和表達模式研究迅速開展，但是關于茶樹COBRA基因家族的研究還未見報道。本試驗通過對茶樹基因組數據進行分析，從茶樹基因組中鑒定到COBRA基因，并對該基因家族成員的蛋白理化性質、亞細胞定位、進化關系、保守結構域、染色體定位等進行生物信息學分析，同時分析了茶樹COBRA家族成員在聚乙二醇(PEG)誘導的干旱脅迫、茉莉酸甲酯處理、鹽脅迫、冷脅迫處理中的轉錄組數據，最后對茶樹進行茉莉酸甲酯處理，基于熒光定量PCR技術的表達水平驗證，為茶樹COBRA家族基因機制和抗逆響應中的功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

貴州大學茶學院種質資源圃中2年生‘福鼎大白茶’茶樹為試驗材料，移栽至人工氣候室(光照：時間14 h，溫度25℃，相對濕度65%，光照強度10000 Lux；黑暗：時間10 h，溫度20℃，相對濕度65%)15 d，用于脅迫表達模式分析。

在茶樹基因組數據庫TPIA(http://tpia.teaplant.org/)、植物基因組數據庫(https://plants.ensembl.org/index.html)、擬南芥基因組數據庫(https://www.arabidopsis.org/)中下載茶樹、煙草、擬南芥的全基因組數據，包括基因組注釋、CDS、染色體定位、蛋白結構等信息，用于茶樹COBRA基因家族的生物信息學分析。

1.2 茶樹COBRA基因家族的篩選與分析

首先從擬南芥基因組數據庫得到擬南芥COBRA基因家族，以擬南芥COBRA基因序列作為參考，在茶樹基因組數據庫得到的茶樹基因組注釋，利用COBRA基因特有的保守結構域模型進行BLASTP比對，設定閾值為E<1e-5，獲得假設CsCOBRA基因。再用NCBI-CDD數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)分析CsCOBRA基因的編碼蛋白特征，確保CsCOBRA基因僅有其COBRA結構域。對獲得序列整理并去除重復項，最后得到茶樹COBRA基因家族成員。根據下載的茶樹基因組數據庫的perl腳本對茶樹COBRA蛋白質的染色體、啟動子、終止子、外顯子、氨基酸長度進行分析，并用http://web.expasy.org/compute_pi/和https://www.genscript.com/tools/wolf-psort在線鑒定其相對分子質量、等電點和亞細胞定位。

1.3 茶樹COBRA基因蛋白保守結構域分析

基于茶樹COBRA蛋白序列結構，在 NCBI-CDD數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)提取茶樹COBRA蛋白序列中相關保守結構域，利用ClustalW程序進行多序列比對，并利用在線軟件TBtools繪制出結構域圖。

1.4 茶樹COBRA基因結構、蛋白保守基序分析

將茶樹COBRA基因組DNA序列和CDS 序列提交至 GSDS 2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)進行基因結構分析，通過MEME(http://meme-suite.org/)進行保守結構域分析，motif數目設置為15個，motif 寬度范圍設置為6～50氨基酸，并利用在線軟件TBtool繪制出保守基序圖。

1.5 茶樹COBRA基因家族順式作用原件分析

用TBtool軟件從基因組序列中獲取起始密碼子上游2000 bp基因序列，并用plant CARE軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析其順式作用原件，確定茶樹COBRA基因家族順式作用原件，結果用Excel制作表格。

1.6 茶樹COBRA系統進化分析

根據ClustalW對下載的擬南芥、煙草與茶樹的COBRA蛋白序列進行多序列比對，比對結果利用MEGA X軟件構建進化樹模型，再利用MEGA10.0的臨近法(neighbor joining，NJ)分析，Boostrap參數設為1000，其他參數為系統默認值，構建系統進化樹。

1.7 茶樹COBRA染色體定位及分布

基于茶樹基因組數據庫TPIA(http://tpia.teaplant.org/)，利用 HMM 3.0 軟件中的 perl 腳本從基因組信息中獲取CsCOBRA基因在染色體上的起始位置信息，利用TBtools軟件基于基因注釋信息對同源關系進行可視化。

1.8 茶樹COBRA表達模式分析

為分析茶樹COBRA基因基因家族的表達情況，從茶樹基因組TPIA數據庫(http://tpia.teaplant.org)下載它們在茶樹8個組織(花、莖、根、頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、果實)及茉莉酸甲酯處理、冷脅迫、鹽脅迫、PEG 誘導的干旱脅迫后的轉錄組數據(TPM值)，同時鑒定差異表達基因，結果使用TBtools軟件制作熱圖，最后選用Adobe Illustrator CS6軟件加工、處理圖片。

1.9 實時熒光定量PCR分析

基于轉錄組數據篩選到的CsCOBRA基因序列，利用IDT(https://sg.idtdna.com/pages)在線設計RT-qPCR引物(表1)，引物序列由北京擎科生物科技有限公司合成。采用CTAB法，提取茉莉酸甲酯處理的福鼎大白茶總RNA，利用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和酸濃度檢測儀檢測其質量和濃度，利用天根Fastking gDNA Dispelling RT SuperMix kit將RNA反轉錄為cDNA。RT-qPCR反應體系：10 μL SYBR Green qPCR Mix，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板1.5 μL，補加ddH2O至20 μL。反應程序：95℃預變性3 min；95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，反應進行40個循環，以茶樹CsGAPDH為內參基因。利用2-ΔΔCT算法[8]計算基因的相對表達量，利用Excel軟件繪制柱狀圖。

表1 熒光定量PCR引物序列

2 結果與分析

2.1 茶樹COBRA基因家族成員鑒定及理化性質預測

通過擬南芥、茶樹基因組數據BLAST比對出來的假設CsCOBRA基因提交到NCBI-CDD在線網站進行保守域的結構驗證，最終得到了16個茶樹COBRA基因，并根據基因在染色體的位置及其同源關系將其命名，進一步對茶樹COBRA基因編碼的蛋白質進行理化性質分析(表2)。結果顯示：茶樹COBRA基因分布于1、2、7、9、11、13號染色體，外顯子數為2～9個，編碼區長度在889(CsCOBRA09)～8742(CsCOBRA08)，相對分子質量最小的是24807.70(CsCOBRA10)，最大的是74813.12(CsCOBRA12)，等電點為5.43(CsCOBRA14)～9.14(CsCOBRA09)，經WOLF-PSORT在線軟件預測蛋白亞細胞定位，結果顯示除CsCOBRA09定位在細胞外，其余茶樹COBRA基因都是定位在細胞膜上。

表2 茶樹COBRA基因家族基因的特征

2.2 茶樹COBRA基因蛋白保守結構域分析

根據茶樹COBRA蛋白序列結構，在NCBI-CDD數據庫提取相關保守結構域，并制作保守結構域圖(圖1)。結果顯示除CsCOBRA09外，每個茶樹COBRA基因僅有一個保守結構域COBRA，說明得到的16個茶樹COBRA基因有很高的保守結構域。

圖1 茶樹COBRA基因蛋白保守結構域圖

2.3 茶樹COBRA基因結構、蛋白保守基序分析

根據茶樹COBRA基因組 DNA 序列和 CDS序列提交至 GSDS 2.0的結果進行基因結構分析，通過 MEME進行保守結構域分析，利用TBtools繪制基因結構、蛋白保守基序(圖2)。據圖2A顯示，CsCOBRA02、CsCOBRA03、CsCOBRA05、CsCOBRA11、CsCOBRA12、CsCOBRA13有部分區段不能翻譯蛋白質,外顯子有2(CsCOBRA11)～9個(CsCOBRA07)；據圖2B的基序顯示，茶樹COBRA家族有一定的保守性，至少有15個保守基序(Motif)以上，由圖可知CsCOBRA的基序個數由3個(CsCOBRA16)到11個(CsCOBRA12、CsCOBRA14、CsCOBRA15)，Motif1～Motif15廣泛分布在茶樹COBRA基因中，CsCOBRA02～CsCOBRA05擁有相同的保守基序，CsCOBRA12、CsCOBRA14、CsCOBRA15也擁有相同的保守基序，Motif1除了CsCOBRA09之外都存在，Motif4、Motif6除了CsCOBRA09、CsCOBRA16不存在之外在其他CsCOBRA都有，Motif2、Motif5、Motif7、Motif8、Motif12分布于茶樹COBRA13條基因中，結果說明Motif1、Motif4、Motif6、Motif2、Motif5、Motif7、Motif8、Motif12在茶樹COBRA基因中發揮著重要的作用。

圖2 茶樹COBRA蛋白的基因結構、保守基序分析

2.4 茶樹COBRA基因家族順式作用原件分析

將鑒定到的16條CsCOBRA基因利用plant CARE軟件確定順式作用原件(表3)，結果表明：有81%(13/16)的CsCOBRA具有光相應原件，說明大多數CsCOBRA家族成員與光反應有關；大多CsCOBRA基因還含有脫落酸、赤霉素、生長素、水楊酸、茉莉酸甲酯等激素類順式作用原件，除此之外還有脫水、低溫、鹽、干旱、冷脅迫的順式作用原件，說明CsCOBRA基因廣泛參與了茶樹生長發育和響應非生物脅迫作用。

表3 茶樹COBRA順式作用元件分析

2.5 茶樹COBRA蛋白序列系統進化分析

為了研究茶樹COBRA基因家族成員的分類，以 11個擬南芥COBRA蛋白和14個煙草COBRA蛋白的蛋白序列作為參考，與篩選得到的16個茶樹COBRA基因蛋白進行多序列比對并構建進化樹(圖3)。結果發現擬南芥、煙草、茶樹COBRA基因在5個亞家族中都有分布，茶樹COBRA基因和擬南芥、煙草同源性很高，COBRA基因物種分化非常保守，3個物種的COBRA基因可能具有相似的生物學功能。根據擬南芥和煙草的同源基因分類，將擬南芥、煙草、茶樹COBRA基因家族分為5個亞家族，茶樹COBRA在GroupⅠ～GroupⅤ亞家族分別有3、2、5、3、3個成員。

圖3 茶樹、煙草和擬南芥COBRA基因家族的進化分析

2.6 茶樹COBRA染色體定位及分布

為了解茶樹COBRA染色體定位分布情況，將鑒定到的16條CsCOBRA基因與茶樹基因組數據庫TPIA比對分析，獲取CsCOBRA基因在染色體上的起始位置信息，利用TBtools軟件繪制染色體定位(圖4)。結果發現除了CsCOBRA13、CsCOBRA16不能定位到染色體外，其余CsCOBRA基因不均勻的分布在Chr1、Chr2、Chr7、Chr9、Chr11、Chr13號染色體上，其中CsCOBRA12、CsCOBRA11、CsCOBRA07分別定位到染色體Chr7、Chr9、Chr11上，CsCOBRA02、CsCOBRA05定位到染色體Chr1，CsCOBRA03、CsCOBRA04、CsCOBRA06、CsCOBRA09、CsCOBRA10定位到染色體Chr2，CsCOBRA01、CsCOBRA08、CsCOBRA14、CsCOBRA15定位到染色體Chr13上。

圖4 茶樹COBRA 基因的染色體位點

2.7 茶樹COBRA表達模式分析

為了解茶樹COBRA基因基因家族的表達情況，從TPIA數據庫下載它們在茶樹8個組織(花、根、莖、嫩葉、成熟葉、老葉、頂芽、果實)的轉錄組數據，結果使用TBtools軟件制作熱圖(圖5)。在不同組織熱圖中結果顯示CsCOBRA01～CsCOBRA16基因在茶樹各部位都有表達，其中CsCOBRA02、CsCOBRA11、CsCOBRA13、CsCOBRA16、CsCOBRA06的表達量較高，CsCOBRA04、CsCOBRA08、CsCOBRA01、CsCOBRA07、CsCOBRA05、CsCOBRA14、CsCOBRA15的表達量較低，CsCOBRA02、CsCOBRA11在根和莖的表達量是最高的，其次CsCOBRA13、CsCOBRA16表達量相同且在花中最高，CsCOBRA03、CsCOBRA09、CsCOBRA10表達量相同且在莖中最高，CsCOBRA01、CsCOBRA07、CsCOBRA08和CsCOBRA14、CsCOBRA15表達量相同在各部位表達量都比較低，由此可見不同CsCOBRA基因參與到茶樹不同部位的生長過程。

圖5 茶樹COBRA基因在不同組織中表達模式

本研究對茶樹CsCOBRA基因在茉莉酸甲酯(0、12、24、48 h)、冷脅迫處理(CK、CK1、CK3)、鹽脅迫(0、24、48、72 h)、干旱脅迫(0、24、48、72 h)4種脅迫的轉錄組數據進行整理，繪制熱圖(圖6)。在茉莉酸甲酯處理后，CsCOBRA02的表達量逐漸升高，CsCOBRA06、CsCOBRA11在12、24 h的表達量降低，后逐漸升高，其余基因隨著時間的推移而表達量沒有明顯的變化，而且表達量都比較低；在冷脅迫下，CsCOBRA02、CsCOBRA06的表達量逐漸升高，CsCOBRA11的表達量稍微提高，CsCOBRA01、CsCOBRA02、CsCOBRA04、CsCOBRA05、CsCOBRA07、CsCOBRA08、CsCOBRA09、CsCOBRA10、CsCOBRA12、CsCOBRA13、CsCOBRA14、CsCOBRA15的表達量受到冷脅迫的影響都很低，有一些甚至不表達；在鹽脅迫下CsCOBRA02、CsCOBRA06、CsCOBRA11的表達量較高，特別是CsCOBRA06基因，其余基因檢測到的表達量都很低；在干旱脅迫下CsCOBRA02、CsCOBRA06、CsCOBRA11的表達量較高。由上可知，CsCOBRA02、CsCOBRA06、CsCOBRA11在不同的脅迫處理下，表達量都相對較高，除了這3種基因外，其余基因在脅迫處理下的表達量都很低，有一些甚至不表達。

圖6 茶樹COBRA基因在茉莉酸甲酯、冷、鹽、和干旱脅迫下的表達分析

2.8 實時熒光定量PCR分析

為驗證轉錄組測序結果的可靠性，本研究根據基因在8個組織(花、莖、根、頂芽、嫩葉、成熟葉、老葉、果實)及4種脅迫(茉莉酸甲酯處理、冷脅迫、鹽脅迫、PEG 誘導的干旱脅迫)的轉錄組數據，選取3個CsCOBRA基因(CsCOBRA02、CsCOBRA06、CsCOBRA11)，對福鼎大白茶樹進行茉莉酸甲酯處理，采用熒光定量PCR技術對CsCOBRA02、CsCOBRA06、CsCOBRA11的表達情況進行了檢測(表4，圖7)。

圖7 RT-PCR分析CsCOBR基因在茉莉酸甲酯處理下的表達分析

表4 RT-PCR分析CsCOBR基因在茉莉酸甲酯處理下的表達分析

結果顯示：茉莉酸甲酯處理0～48 h，CsCOBRA02在6 h時表達量最高，之后表達量由高到低，最后升高；CsCOBRA06和CsCOBRA11的表達量大致走向由高到低，而后繼續升高。在12 h時CsCOBRA02、CsCOBRA06、CsCOBRA11表達量最低，為7.1517、4.6205、7.0950。RT-PCR熒光定量分析與轉錄組茉莉酸甲酯處理數據表達量有所差異，但是表達趨勢基本一致。

3 結論

COBRA基因家族的研究在高粱[9]、亞麻[10]、冬棗[11]、毛果楊[12]、棉花[13]、玉米[14]等物種中鑒定出相關成員，家族成員數量分別是10、24、10、14、9、19個。本研究鑒別茶樹COBRA基因家族總共有16個成員，與高粱、亞麻、冬棗、毛果楊、棉花、玉米鑒定出來的家族成員數量沒有太大的差異，說明鑒定結果有一定的可靠性。根據理化性質分析，相對分子質量24807.70～74813.12，等電點為5.43～9.14，亞細胞定位顯示CsCOBRA基因幾乎都是定位在細胞膜上；CsCOBRA基因幾乎只有一個保守結構域COBRA，說明茶樹COBRA基因非常保守；CsCOBRA基因的蛋白結構、保守基序(motif)也是均勻分布；茶樹COBRA基因與擬南芥、煙草的多序列比對結果表明，茶樹COBRA基因在5個亞家族中都有分布，擬南芥、煙草、茶樹的COBRA基因同源性很高；茶樹COBRA基因均勻分布在各染色體上；8個組織和茉莉酸甲酯處理、冷脅迫、鹽脅迫、PEG 誘導的干旱脅迫后的轉錄組數據得到熱圖，CsCOBRA02、CsCOBRA06、CsCOBRA11在不同的脅迫處理下，表達量都很高，所以將CsCOBRA02、CsCOBRA06、CsCOBRA11設計特異性引物，在不同時間的茉莉酸甲酯處理下熒光定量PCR分析，結果說明3個CsCOBRA基因表達量趨勢大致與轉錄組數據一致。

COBRA基因編碼一種糖磷脂酰肌醇錨定蛋白，控制細胞壁、纖維素微纖絲的正確定位和細胞的定向伸長，對植物器官的形態發生起重要作用，與植物的壽命、體積、高度、細胞壁的機械強度有關[15]。茶樹是多年生植物，是我國重要的經濟作物。茶樹的生長發育，會受到環境和人為的影響，研究結果顯示CsCOBRA基因可能與茶樹的細胞壁、纖維素，還有壽命、機械強度有關，間接影響茶葉的產量。目前對茶樹COBRA基因家族的研究還未見報道，本研究對茶樹COBRA基因進行鑒定分析，將為深入了解茶樹COBRA基因奠定基礎。