非痰液樣本結核分枝桿菌游離DNA檢測在結核病診斷中的研究進展

李靜 張燕 仵倩紅

據世界衛生組織(World Health Organization，WHO)報道，全球范圍內仍有近1/3的結核病患者未被診斷或報道，漏診或漏報現象在兒童結核病、肺外結核和并發艾滋病患者中尤為明顯[1]。兒童患者的呼吸道樣本多為少菌型，許多HIV感染者也不能獲取到檢測結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)所需的標準呼吸道樣本，均難以實現呼吸道樣本的檢測作用[2]，找到一種快速、低成本的非痰液診斷技術成為當前迫切所需[3]。抗酸桿菌涂片或分枝桿菌培養法一直是結核病診斷的“金標準”[4]，但對于非痰液樣本(如血液、尿液等)，涂片法的陽性率更低，培養周期也過長，均難以滿足臨床檢測的需求。而免疫學和分子生物學技術雖然在診斷敏感性和檢測速度等方面較傳統方法有了很大進展，但仍存在成本高、結果難以規范化、適用人群不廣泛等諸多問題[5]。游離DNA(cell-free DNA，cfDNA)的檢測在這種情況下應運而生，因其具有無創取材、樣本易留取等特點，逐漸受到國內外研究人員的重視，成為結核病非痰液樣本檢測研究的熱點，彌補了特殊結核病患者診斷的局限性。

一、cfDNA的來源及應用現狀

cfDNA是游離核酸的一種存在于生物體液中無細胞狀態的胞外DNA片段，有著比DNA更低的相對分子質量，常以70～200 bp短片段或21 kb長片段的DNA-蛋白質復合物形式存在[6]，被普遍認為是細胞壞死和凋亡過程中釋放出來的[7-10]。細胞壞死后，由巨噬細胞對細胞碎片進行消化，從而將DNA片段釋放到血液中；或在細胞凋亡時，大多數細胞的形態學發生改變，細胞核固縮，DNA斷裂并釋放入血[11-12]。當前，cfDNA廣泛應用于病原體檢測、早期產前胎兒基因檢測、卵巢腫瘤、宮頸腫瘤、肝癌或肝相關性寄生蟲病等[13-17]，且診斷價值較高；而對于結核病領域，cfDNA的臨床應用仍相對較新，目前尚不能直接應用于臨床，但較多研究已在人體血液、胸腔積液、腦脊液及尿液等多種體液中檢出cfDNA[18-21]，故認為cfDNA檢測在結核病領域中具有廣闊的應用前景。

二、影響血液和尿液樣本中MTB-cfDNA檢測前處理的因素

cfDNA是一種很有吸引力的檢測和監測肺結核及肺外結核的生物標志物，但對肺結核和肺外結核患者的血液、胸腔積液、腦脊液和尿液等樣本進行cfDNA檢測的敏感度和特異度差異較大，分別介于29%～79%和67%～100%之間[18-21]，與WHO對新型結核病診斷優先目標產品的性能要求仍有一定差距。這可能與cfDNA半衰期短、穩定性較基因組DNA差、檢測方法不一致有關，且這些研究均側重于對其方法的對比，對樣本分析前的影響因素涉及較少。

研究表明，在胎兒和腫瘤領域的cfDNA前處理方式不太適用于結核病領域的研究[22-25]，這使得開發適用于結核病檢測的MTB-cfDNA前處理技術更具潛力。雖然美國Streck公司研發的BCT采血管可降低基因組DNA的釋放，也可明顯減少背景DNA的干擾，但其成本太高。2016年，Medina等[26]采用BCT采血管與乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)采血管進行對比采集血液，室溫保存5 d，發現EDTA-K2采血管中cfDNA水平明顯升高且穩定，但未分析其原因。2018年，Leng等[27]評估了cfDNA濃度及鏈完整性在非小細胞肺癌與結核病鑒別診斷中的潛在臨床價值。所有受試者在采樣前均未使用任何抗腫瘤或抗結核藥物。分別采集受試者5 ml血液于含EDTA-K2的采血管中收集血漿，發現EDTA-K2可更好地保持cfDNA濃度及鏈完整性，且非小細胞肺癌患者的cfDNA濃度水平和鏈完整性明顯高于結核病患者，提示EDTA-K2采血管可提高cfDNA的檢測水平，且cfDNA釋放量在癌性樣本中更多，相較于傳統腫瘤標志物[如CA125、血清神經元特異性烯醇酶(NSE)和癌胚抗原(CEA)]，cfDNA鏈完整性對非小細胞肺癌和結核病的區分效果更高，認為cfDNA檢測可作為鑒別結核病和非小細胞肺癌的指標。

2019年，Murugesan等[28]發表了對于影響血液和尿液中病原體cfDNA分析前變量的研究。該研究采集健康獻血者的血液和尿液標本，并加入MTB-cfDNA制成人工樣本；同時采集結核病患者的血液和尿液標本，通過研究兩種方式在采血管和尿液的保存方式、處理延遲、樣本量、是否凍融等方面的差異，評價影響檢測cfDNA結果的因素。結果發現，與Streck采血管(含有EDTA-K2抗凝血劑和一種液態的細胞防腐劑)和靜脈真空采血管(PAXgene)相比，加入MTB-cfDNA 的EDTA-K2血液采集管可以產生同等數量或更高水平的MTB-cfDNA；而在尿液中添加防腐劑也可有效防止MTB-cfDNA降解，但其效果要低于25 mmol/L的EDTA。在檢測活動性結核病患者的血漿和尿液時，EDTA-K2 采集的血液和25 mmol/L EDTA保存的尿液中MTB-cfDNA的釋放量要優于Streck采血管，且能在室溫下穩定24 h。若在這24 h內單次低速離心血液樣本則可明顯增加MTB-cfDNA的釋放量，但尿液樣本的MTB-cfDNA釋放量不受這一操作的影響。同時還發現，在人工樣本和結核病患者樣本中，體積量越大的血漿和尿液越可獲得豐度更高的MTB-cfDNA；而在-80 ℃保存24周后的血漿和尿液樣本中，其冷凍和解凍后MTB-cfDNA的豐度水平不受任何影響。故認為，將EDTA-K2采血管、單次低速離心及24 h延遲處理相結合可以產生更多的MTB-cfDNA，而且EDTA-K2管是實驗室中最常見的采血管，其價格低廉，更適合推廣使用。這幾項處理前影響因素進一步優化和改進了MTB-cfDNA的獲取方式，可為資源有限的廣大研究者提供更好的選擇和研究思路。但這些研究也有一定局限性，具體如下：(1)研究中結核病患者樣本與人工樣本的結果非常相似，但并非所有人工樣本的結果都能得到證實。(2)研究的組別間可能存在重疊，可能造成統計誤差，臨床意義還需進一步研究。(3)比較血清或血漿中的MTB-cfDNA時，沒有納入血清采集管、肝素抗凝管，避免因抗凝劑不同而對收集效果產生不同影響。(4)未對超過24 h的前處理進行研究。

三、血液及尿液中MTB-cfDNA的提取

cfDNA有著比DNA更低的相對分子質量，血漿cfDNA主要是核小體，峰值長度為160～167 bp；而尿液cfDNA的峰值長度是由腎小球濾過功能決定的。這就要求所有尿液cfDNA片段需進一步迅速降解[29-32]，使得大部分碎片要低于100 bp，甚至低至30～60 bp[31,33-34]。對cfDNA片段大小的分析是評價cfDNA提取試劑盒的關鍵，而樣本中cfDNA能否表現出高度片段化則是cfDNA提取的關鍵。當前，市面上研發出較多提取cfDNA不同片段的產品，然而不同的提取方法對cfDNA的回收率也不同。主要的提取方法有：基于硅膜的旋轉柱技術、基于磁珠的分級篩選法和相分離法[35-36]，而前者是cfDNA提取量最大最純的一種方法，以德國Qiagen公司的QIAamp游離核酸提取試劑盒應用最廣泛。

2015年，Mauger等[37]比較了從不同血漿樣品中分離cfDNA的11種提取方法，發現QIAamp和Norgen游離核酸提取試劑盒的準確性和重復性均最好，QIAamp游離核酸提取試劑盒的回收率最高，但因QIAamp試劑盒在cfDNA提取方面具有較大壟斷性，導致經濟成本較高。2018年，我國潘杰等[38]使用國產柱式cfDNA提取試劑盒對血漿cfDNA 提取效率、片段分布(102、268、402 bp)及不同片段DNA的回收率等方面進行了研究，發現使用國產試劑提取的cfDNA在102、268和402 bp處的條帶強度均明顯高于德國Qiagen公司相關產品，提示在提取效率上國產試劑可能優于Qiagen產品，國產柱式在各項評價性能上均可與Qiagen 產品媲美。但這兩項研究只表明了這些產品在大于100 bp片段中的效果，對于低于100 bp的效果和是否適用于其他樣本并未進行研究和說明。

2021年，Vogt等[39]在南非納入9例淋巴瘤并發HIV感染患者和8例結核病并發HIV感染患者，收集全血樣本于細胞專用管中，評估血漿cfDNA的數量和質量，通過下一代測序技術(next-generation sequencing，NGS)評估cfDNA的鑒別診斷能力。研究為獲取高質量的cfDNA，采用了高敏感度的電泳法來評價cfDNA豐度，將測量90～400 bp內具有特征譜的片段指定為cfDNA，將>500 bp的片段指定為基因組DNA。結果顯示，cfDNA的片段長度是一個限制因素，在400～500 bp間未能檢測到DNA，在200～250 bp間血漿cfDNA的豐度最高，而<100 bp和>250 bp的片段均很少。淋巴瘤患者的顯性cfDNA分子長度為130(95%CI：119.0～136.0)bp，與結核病患者的長度[139.5(95%CI：119.0～184.0)bp]接近；而繼發性患者cfDNA分子的中位測量值為236(95%CI：205.0～287.0)bp，低于結核病患者[252.0(95%CI：222.0～335.0)bp]。定量結果顯示，cfDNA在淋巴瘤患者中最為豐富，在淋巴瘤患者中cfDNA占所有分離DNA的91%(95%CI：89%～96%)，高于結核病患者的86%(95%CI：74%～93%)。這項研究結果為進一步研究結核病患者血液樣本中cfDNA片段長度的選擇提供了有力的依據，在此基礎上選擇適當的樣本管直接采集并運輸血液樣本至實驗室，有利于分離出高質量的cfDNA，可避免低質量cfDNA產生假陰性結果，但由于此研究樣本量太小，限制了對NGS技術臨床檢測效能的評估，但仍可為研究人員提供一個新的研究思路。

這里特別要提到Oreskovic等[40]于2019年發表的尿液中小片段cfDNA提取方法的分析研究。這項研究從對片段長度的依賴性、低濃度萃取實驗、不同條件下尿液的耐受性和對PCR抑制的敏感性幾個方面比較了2種已發表的方案(Wizard/GuSCN和QSepharose)、3種商業核酸提取試劑盒(Norgen、QIAamp和MagMAX)和1種特異性內部序列雜交捕獲技術的性能分析。研究內容如下：(1)選取長度為25、40、80 bp或150 bp的合成DNA靶蛋白，評估尿液cfDNA提取方法對片段長度的依賴性。結果顯示，每一種提取方法在不同片段長度上的回收率均有所不同。雜交捕獲是惟一能在25～150 bp所有片段長度上保持高回收率(73%～84%)的方法，QSepharose方案對40～150 bp片段也有類似的高回收率(63%～75%)，但對最短的25 bp片段的回收率較低(9%)。Wizard/GuSCN方案依賴于尿液成分，特別是pH值和DNA濃度，即使在調整尿液到最佳條件下，其回收率仍然很低(9%～17%)。Norgen試劑盒對40～150 bp片段的回收率為30%～41%，對25 bp片段的回收率為72%，說明此種方法更適合于片段較低的尿液樣本。QIAamp試劑盒對150 bp片段的回收率約為18%，且對較短的40 bp和80 bp片段的回收率更低，分別為0.2%和1%，說明這個廣受推薦的商業試劑盒更適用于血漿而不是碎片較多的尿液。MagMAX試劑盒對150 bp片段的回收率較高(66%)，但隨著片段長度的減少回收率也很快降低，對40 bp片段的回收率幾乎不存在(0.2%)。(2)低濃度萃取實驗：在低濃度樣本中，雜交捕獲和三甲胺基烷基季銨基團瓊脂糖凝膠電泳法可快速檢測出所有陽性樣本，而QIAamp和MagMAX試劑盒檢測不出任何陽性樣本。(3)不同條件下(pH值、背景DNA濃度和無機鹽的變化)，Wizard/GuSCN方案的回收率高度依賴尿液條件，特別是pH值和背景DNA濃度，而無機鹽的變化對回收率沒有影響；表現為pH值高于6會降低回收率，背景DNA濃度增加會提高回收率，但最大回收率仍遠低于其他方法，認為與其他方法能很好地耐受pH值、背景DNA濃度和無機鹽的變化有關。(4)PCR抑制敏感性。雜交捕獲、Wizard/GuSCN、QSepharose和QIAamp檢測對高達40%的洗脫液均具有抗性，但Wizard/GuSCN和QSepharose 兩種方法的洗脫液隨濃度增加，抗性會減弱。MagMAX在20%洗脫液中受輕度抑制，在40%洗脫液中受嚴重抑制。Norgen在所有測試條件下均產生抑制，在40%洗脫液下無擴增。總之，雜交捕獲和QSepharose效果最好，表現為對25 bp和40 bp短片段回收率高，對濃度檢測敏感度高、對不同尿液有一定耐受能力，對PCR抑制有抗性。基于此，兩者已被推薦用于尿液cfDNA的提取，但二者在臨床樣本中的檢測效果仍未明確，期望早日獲得理想效果。

四、cfDNA的檢測方法

隨著現代技術的不斷應用，現已開發出多種cfDNA檢測技術，這些方法可在2 d內報告結果，可快速高效地進行臨床診斷，目前主要集中為以下兩種：一種是靶向DNA測序技術，如實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)、數字PCR(digital PCR，dPCR)、微滴式數字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)和巢式PCR等[41-43]；一種是非靶向第二代測序技術，如全外顯子測序和全基因組測序[44]，其中以MTB-cfDNA qPCR在結核病領域中應用最廣，已成為結核病檢測的常規方法。

1.血液樣本cfDNA檢測：2017年，Click等[45]納入痰涂片均為陽性且均無分枝桿菌菌血癥的32例HIV感染者和18例非HIV感染者，應用MTB-cfDNA qPCR技術從40例結核病患者血漿中檢測出18例(45%)陽性，而GeneXpert MTB/RIF(簡稱“Xpert”)檢測30份血漿，無一例陽性，表明MTB-cfDNA qPCR檢測血漿診斷結核病具有可行性，為免疫功能低下的患者創造了新的檢測起點。同年，Yang等[46]通過dPCR技術也檢測到肺結核和肺外結核患者血液中的cfDNA，表明MTB-cfDNA dPCR檢測對肺外結核的診斷也有潛在價值。2018年，Yamamoto等[47]應用dPCR檢測1例血行播散性結核病患者中cfDNA的來源，這位患者痰液、血液、尿液標本經抗酸染色及qPCR均未檢測到MTB，而此次利用dPCR則從血液標本中檢測出MTB-cfDNA，且擴增陽性，與最終診斷相符合，這為肺結核和肺外結核的診斷提供了一種新型且侵襲性小的檢測工具。2021年，Pan等[48]納入了24例肺結核患者和57例結核分枝桿菌潛伏感染者(LTBI者)作為研究組和對照組，采用qPCR和ddPCR對血漿樣本進行檢測，評估cfDNA對診斷肺結核的敏感度和特異度，發現54.2%的肺結核患者可被檢測到MTB-cfDNA，且MTB-cfDNA陽性與γ-干擾素(IFN-γ)反應水平相關，經過抗結核治療后的患者MTB-cfDNA水平明顯下降，表明治療后的結核病患者MTB-cfDNA的釋放量減少。該研究首次在LTBI者血漿標本中檢測出cfDNA，提示血漿MTB-cfDNA是一種檢測和監測結核感染與免疫相關的微生物學指標，但該研究樣本量較小，仍需要大規模隊列研究來評估血漿cfDNA檢測在有結核病接觸史和LTBI者治療監測中的價值。

2.尿液樣本cfDNA檢測：近兩年，由于尿液樣本易收集、無創性留取的特點，以尿液為基礎的各種診斷方法也成為研究的熱點，尿液MTB-cfDNA則成為一種很有前途的結核病生物標志物，而據此檢測肺結核和肺外結核患者的敏感度和特異度分別為43%～79%和89%～100%[47]。2021年，MacLean和Nathavitharana[49]回顧性研究了南非和美國地區的活動性肺結核患者的73份冷凍尿液樣本。結果顯示，MTB-cfDNA qPCR檢測的敏感度為83.7%(95%CI：71.0%～91.5%)，特異度為100.0%(95%CI：86.2%～100.0%)，符合WHO公布的性能標準；而對未感染HIV的人群和涂片陰性的結核病患者檢測的敏感度分別為73.3%(95%CI：48.1%～89.1%)和76%(95%CI：56.5%～88.5%)。研究也指出，獲取尿液MTB-cfDNA 是一個高度復雜的過程，需要專門的試劑、實驗室設備和訓練有素的技術人員來完成樣品制備，如果能在檢驗前獲取一份高質量的尿液樣本，MTB-cfDNA將會成為一個很好的生物標志物。

3.其他非痰液樣本cfDNA檢測：由于兒童結核病、肺外結核和艾滋病并發肺結核患者不具有特異性的臨床表現，也缺乏敏感的診斷工具，臨床診斷充滿挑戰。在MTB樣本留取過程中，除方便采集的血液和尿液樣本外，其他非痰液樣本中檢測MTB-cfDNA的價值也逐步得到研究。Che等[50]首次在結核病患者的胸腔積液中檢測出MTB-cfDNA，并將培養法、Xpert法和MTB-cfDNA qPCR檢測進行比對分析，三者檢測的敏感度分別為27.1%(95%CI：19.2%～34.9%)、38.5%(95%CI：29.9%～47.2%)和79.5%(95%CI：72.4%～86.7%)。壽娟等[51]檢測結核性胸膜炎患者胸腔積液中的MTB，發現MTB-cfDNA qPCR法的檢測敏感度(63.11%)明顯高于涂片法(11.65%)，說明qPCR技術檢測結核病患者胸腔積液中的cfDNA，是一種快速準確的診斷方法。Li等[52]也采用涂片法、培養法、Xpert法和MTB-cfDNA qPCR多種方法檢測結核性腦膜炎患者的腦脊液樣本，發現他們的檢測敏感度分別為2.2%、13.0%、23.9%和56.5%。Sharma等[53]首次在結核病患者腹腔積液樣本中檢測出MTB-cfDNA，并參照綜合參考標準(CRS)對qPCR與Xpert法診斷腹部結核的準確性進行評價，發現qPCR對確定和可能的腹部結核的診斷敏感度為66.7%(95%CI：40.9%～86.7%)，特異度為97.1%(95%CI：84.7%～99.9%)；而對特異度相近患者的檢測敏感度可提高到70.9%(95%CI：51.9%～85.8%)，而Xpert檢測的敏感度僅為16.7%，但特異度為100.0%(95%CI：89.7%～100.0%)。這些研究均顯示，MTB-cfDNA qPCR檢測結核病的敏感度遠高于其他方法，且陽性檢出率明顯提高，是一種準確的分子檢測方法，可為MTB的病原學檢測提供直接證據。

2021年6月發表了一篇應用MTB-cfDNA診斷結核病有效性的系統回顧性薈萃分析[54]，該分析包括了15項在結核病流行地區進行的研究，其中13項在中國、1項在印度、1項在南非；主要使用血液、尿液、腦脊液、胸腔積液和腹腔積液等非痰液樣本；共納入18篇文章，其中14篇是cfDNA與綜合參考標準(CRS)比較的獨立研究，4篇是與MTB培養法比較的獨立研究。相較于綜合參考標準和培養法結果，MTB-cfDNA檢測的敏感度、特異度、曲線下面積(AUC)分別為68%、98%、0.97和48%、91%、0.88，各研究間雖異質性明顯，但這些結果均表明cfDNA檢測對診斷結核病的準確性明顯優于綜合參考標準和培養法，對肺結核和肺外結核具有良好的診斷性能，且可用于結核病的早期快速診斷。但這些研究的主要對象為成年人，仍缺乏兒童患者相關數據。另外，該研究結果顯示，檢測結核性胸膜炎中cfDNA的診斷價值最高，其次是結核性腦膜炎和腹部結核，雖然這幾項研究樣本量均較少，但不可否認，cfDNA檢測有望成為少菌型結核病的有效診斷方法，為臨床診斷結核病提供強有力的輔助支撐。

五、總結與展望

結核病仍然是全球衛生問題的一個重大挑戰，雖然痰液和灌洗液是診斷結核病的傳統樣本，但難以用于兒童結核病、肺外結核、艾滋病并發肺結核和無痰/少痰者，且肺泡灌洗液取材具有侵入性，患者耐受性差。而MTB-cfDNA qPCR檢測技術是以非痰液樣本為檢測基礎，具有廣泛的應用前景。盡管目前還沒有該技術標準化的共識或指南，也在結核病研究領域中處于起步階段，但近兩年已在血液和尿液樣本的前處理及提取方面取得了很大突破，可通過PCR技術檢測結核病患者的血液、尿液等非痰液標本中的cfDNA，并獲得較高的敏感度。然而，作為一種新型的分子標志物檢測仍存在一些亟待解決的問題，一是提取早期患者的cfDNA難度較高，穩定性較差，需消耗大量的精力和物力，且缺乏對提取物標準化和科學的質量控制，尚不能指導臨床應用。但不可否認，在具備合適的前處理、提取方法和檢測方法的基礎上，cfDNA檢測仍具有巨大的研究潛力。二是cfDNA檢測可能在有結核病治療史的患者中特異度較低，其良好生物學特性可能僅適用于活動性結核病患者和LTBI者，相信在進一步的研究中一定能開啟結核病快速診斷的新篇章。