多孔鉭 - 細胞 - 骨界面作用的研究進展

陳凱 宋會平

醫用金屬材料在臨床骨科、牙科等領域應用廣泛，作為一種生物替代材料，修復、提升、重建或替代機體原有組織結構是此類材料被探索和開發的潛能所在[1]。當前臨床應用較多的醫用金屬材料主要有鈦及鈦合金、鈷鉻合金和不銹鋼等[2]，類似于人體松質骨結構[2-3]的多孔鉭作為一種有前途的生物材料[4-6]，在促進各類骨細胞增殖、分化形成成熟組織等方面均表現出優于其它現有金屬植入材料的生物相容性[4]，除了在髖關節置換和翻修的臨床應用中發揮了優良的骨長入和穩定性，在膝關節[7]、踝關節[8]以及脊柱[9]損傷的修復中同樣展現了良好的骨整合能力，但是鉭 - 細胞 - 骨界面整合有限、制作工藝難、成本高阻礙了多孔鉭作為植入材料在臨床骨缺損、骨重建與修復以及骨替代等治療方面的推廣，筆者主要就多孔鉭與各種骨細胞作用、多孔鉭骨整合界面特性作簡要討論。

一、多孔鉭與骨髓基質干細胞 ( bone marrow stromal stem cells，BMSCs )

1. 多孔鉭 - 細胞復合物誘導骨分化：BMSCs 在體內結合可改善成骨，促進骨形成和骨骼發育[3]。BMSCs 在生物材料的骨再生和骨整合過程中起著至關重要的作用[10-11]，具有分化為成骨細胞、軟骨細胞和脂肪細胞的潛力[12]且相對容易被分離出來用于其它研究，為骨組織工程提供了良好的骨祖細胞來源[13-14]。在體外和體內實驗方面，Wei 等[3]和 Wang 等[15]采用了化學氣相沉積法制備了網狀玻璃碳多孔鉭并評估了鉭的生物活性：與對照組相比，前者實驗中所用的 BMSCs 和后者的成骨細胞增殖均沒有受到抑制，直接表明多孔鉭對細胞增殖無明顯毒性[16]；同時，Wei 團隊將帶有 BMSCs 的多孔鉭分別在體外培養和植入犬體內并對細胞的黏附、增殖、擴散及形態觀察發現，隨著時間延長，與無鉭對照組相比，無論是在體內還是體外，多孔鉭 - BMSCs 復合材料均表現出優異的促進細胞黏附和擴散的能力，細胞由最初的紡錘形逐漸增殖分化為多種形狀且相互連接，促進了 BMSCs 向成骨細胞方向分化，形成新生骨小梁。在臨床應用中，Zhao 等[17]使用多孔鉭 - BMSCs - 血管化骨復合移植物對人股骨頭壞死 Ⅲc 期和 Ⅳ 期患者進行臨床治療并長期隨訪，與單血管化骨移植相比，無論是術后 5 年移植成功率還是代表治療效果與預后的平均 Harris 髖關節得分 [ 從 ( 38.74±5.88 ) 分提高至 ( 77.23±14.75 ) 分 ] 均顯著提高；這一指標在 Ⅰ 期和 Ⅱ 期手術時則由 62 分顯著提高至 92 分[18]。多孔鉭 - BMSCs 界面骨整合有利于延遲或避免晚期股骨頭壞死的全髖關節置換。

2. 多孔鉭激活分子信號通路增強骨誘導：作為極具分化潛力的干細胞，BMSCs 成骨化的過程受到多種信號通路和調節因子的影響，BMP2 / Smads 途徑、MAPK / ERK 信號通路等參與其中。骨形態發生蛋白 2 ( BMP2 ) 參與 BMSCs 成骨化誘導，小母體 - 十五倍體同源物 ( small mothers against deca-pentaplegic homologs，Smads ) 激活介導 BMP2 信號以促進 BMSCs 的成骨化[19]。Lu 等[20]解釋了骨質疏松模型下鉭 - BMSCs 復合材料激活 BMP2 / Smad1 信號傳導以誘導成骨分化的過程，與鈦組相比，鉭組的礦化水平、BMP2、Smad1、RUNX2 和堿性磷酸酶 ( ALP ) 表達水平均占有明顯的優勢 ( 約為鈦的 1.2～1.8 倍 )；反之，在使用 BMP2 或 Smad1 抑制劑后，RUNX2 和 ALP 表達水平則大大降低 ( 下降 50%～70% )；也就是說，在這一過程中，鉭首先激活了 BMP2 / Smads 的信號傳導，BMP2 水平的提高、Smad1 的磷酸化表達誘導 RUNX2 和 ALP 水平的顯著增高，表明 BMSCs 向成骨方向分化，這一過程還可能因為鉭表面 BMP2 本身的自我誘導能力而被放大，進一步增強鉭的骨誘導能力。

絲裂原激活的蛋白激酶 ( MAPK ) 家族是調節 BMSCs 成骨化的潛在機制，其中 MAPK / ERK ( mitogen-activated protein kinase / extra-cellular signal-regulated kinase ) 信號通路的激活或抑制直接影響了 BMSCs 的分化與否[21]。Dou 等[22]的研究發現促進 BMSCs 成骨化的過程與多孔鉭激活 MAPK / ERK 信號通路有關，制備出完全相同孔徑、孔隙率和形狀的多孔鉭和多孔鈦兩種材料，使用大鼠第三代 BMSCs 進行體外實驗：在細胞的黏附、增殖測定以及成骨基因表達水平測定中，鉭均表現出顯著高于鈦的成骨分化；關鍵指標 p-ERK ( MAPK / ERK 信號通路的效應蛋白 ) 測定同樣顯示鉭組優于鈦組；選擇性抑制 MAPK / ERK 信號傳導途徑的 p-ERK 水平，進一步表明鉭通過激活 MAPK / ERK 信號通路，增加其效應蛋白 p-ERK 的表達并促進了 ALP 及其它成骨基因的表達，進而誘導 BMSCs 的體外成骨化。

二、多孔鉭與成骨細胞

1. 多孔鉭契合骨生理并促進骨分化：在成骨細胞分化成熟的過程中，ALP、Ⅰ 型膠原蛋白 ( COL-1 )、骨唾液蛋白 ( BSP-1 )、骨鈣素 ( OCN ) 等細胞基質以及鈣含量的測定具有重要意義。ALP、COL-1 被看做是早期分化標志物，OCN 和鈣含量則被認為是晚期分化和礦化的標志物[22-23]。在 Sagomonyants 等[24]的研究中分別比較了 45 歲以下和 60 歲以上女性患者成骨細胞在多孔鉭、鈦網和塑料培養基上的黏附、增殖、分化及礦化情況發現：黏附在鉭上的細胞數量明顯多于鈦網和塑料培養基 ( 多 25%～30% )； 對年輕和老年患者的細胞增殖測定顯示鉭組分別比鈦網組增長 3.7 和 5.9 倍，比塑料組分別提高 11.6 和 16.4 倍；在細胞分化的初始階段，ALP 在 90% 以上的成骨細胞中表達，而到了 3 周時，鉭基上 ALP 的表達水平最低，COL-1、OCN 和鈣含量則最高，表明多孔鉭促進成骨細胞依序由早期分化進入高度分化、趨于成熟的礦化階段；Welldon 等[25]通過測定單克隆抗體 STRO-1 和抗堿性磷酸酶染色細胞 ( AP ) 以表征成骨細胞的分化程度，分化順序依次由 AP-STRO1+，AP+STRO1+，AP+STRO1-和 AP-STRO1-細胞[26]4 個亞群表征，在 2 周時 ( 分化中晚期 ) 多孔鉭上 ALP 高表達和 STRO-1 低表達 ( 即高度分化的 AP-STRO1-階段 )、BSP-1 和 COL-1 持續低表達。作為早期分化標志的 COL-1、BSP-1 隨分化的進行逐漸下調，AP-STRO1-的高表達表明進入到中晚期高度分化的階段，Sagomonyants 和 Welldon 的實驗證明了鉭 - 細胞界面作用遵循成骨基因表達順序，這種高度契合骨形成生理過程特性為它發揮良好的促細胞成熟提供了條件，而早期分化標志物 ALP 在分化中晚期依然表現出較高的水平，除了觀察時間的選擇不同，可能與多孔鉭的“延遲成熟”有關。

2. 多孔鉭延遲成熟作用：成骨細胞的成熟部分受經典 Wnt 信號通路的調節，此通路可致轉錄因子 RUNX2 的上調并促進成骨，Ninomiya 等[27]比較了成骨細胞在多孔鉭、鈦網和鈷鉻珠界面上的成熟度，早期 ( 4～7 天 ) 即在多孔鉭表面和內部發現數量最多的成骨細胞，對 RUNX2 因子活化測定發現，鈦與鈷鉻珠界面 RUNX2 的表達在 5～11 天時達到峰值，而多孔鉭 RUNX2 的上調則延遲到 11 天時剛剛開始，致使骨基質 OCN 分泌和 ALP 活化同樣延遲，OCN 和 ALP 低水平表達持續 3 周，而 3 周后對各組成骨細胞礦化水平的測試發現，鉭組表現出最為顯著的礦化增加，說明多孔鉭在早期促使細胞內生長并布滿鉭表面后，才開始成骨細胞的分化成熟過程和新骨的形成，稱之為“延遲成熟”，延遲后 ALP 中晚期表達水平增高，骨成熟和骨長入在 RUNX2 上調延遲的情況下更加充分完整。Wang 等[15]證實成骨過程在植入后的早期階段 ( 1 周內 ) 僅發生在宿主骨的表面上，且骨的形成與長入是時間依賴性 ( 3 周左右 ) 的，鉭 - 宿主骨界面處的新骨組織會隨著時間的流逝而成熟，鈣的沉積隨后發生，在遵循了良好基因表達順序的同時，通過“延遲成熟”機制促進成骨細胞的成熟和長入。

3. 多孔鉭抑制 MAPK / p38 信號通路加強骨保護：ERK，p38 和 JNK 分子是 MAPK 家族的三大成員，在氧化應激條件下，MAPK / ERK 信號通路促進細胞有絲分裂與成骨細胞存活，MAPK / p38 信號通路導致成骨細胞功能障礙、細胞凋亡和線粒體死亡[28-29]。Wang 等[30]比較了糖尿病模型下綿羊體內多孔鉭與鈦對骨缺損修復及作用機制研究，結果發現鉭組成骨細胞的數量、形態、ALP 活性及礦化水平均遠高于鈦組且極少出現細胞凋亡；鈦組的 MAPK / p38 水平遠高于鉭組，MAPK / p38 過度磷酸化，導致細胞凋亡；在使用抑制劑抑制 MAPK / p38 的磷酸化后，鈦組細胞活性與增殖分化能力均顯著恢復到鉭組水平，表明多孔鉭自身即可抑制活性氧的產生與 MAPK / p38 的過度表達，加強成骨細胞保護。

在臨床骨缺損患者中，合并有類似糖尿病等嚴重影響機體氧化代謝疾病的患者極為常見，多孔鉭在發揮其自身抗氧化能力抑制 MAPK / p38 信號通路表達、加強骨保護的同時，又能激活 MAPK / ERK 信號通路，增強 BMSCs 成骨化，拓寬了多孔鉭在臨床使用的適應證與使用人群；諸如 BMP2、BMP7 等蛋白修飾下的多孔鉭在基礎實驗中同樣展現出遠優于單純鉭的生物整合能力[31]，為臨床骨缺損伴韌帶、肌腱的修復方法提供了參考依據。

4. 多孔鉭 - 骨界面錨定：多孔鉭修復骨缺損的過程中，骨組織向內生長，一方面體現了鉭周圍骨組織生長修復的過程，另一方面，生長入孔的各種骨組織與周圍的松質骨相互交錯所帶來的黏附力、把持力在一定程度上可以發揮金屬螺釘的錨定作用，增加植入物的穩定性。Welldon 等[25]在動物模型中比較了多孔鉭與固體鉭或塑料上成骨細胞的長入情況發現，在第 3、14、21 天分別觀察到成骨細胞長入孔內距離金屬表面 52.8 μm、103.2 μm 和 189.6 μm 的位置；Fernández-Fairen 等[32]則在臨床多孔鉭全髖關節置換治療中測量了該指標：在術后 6 周、6 個月及 20 個月測得骨組織長入的深度分別達鉭孔內 0.68～1.14 mm、1.12～3.53 mm 和全孔 ( 5 mm ) 的位置，覆蓋面積分別達鉭孔的 ( 13.1±4.8 ) %、( 50.7±10.4 ) % 和 ( 76.0±10.9 ) % 的水平。隨著制造工藝水平的提升，更高孔隙率、更復雜的多孔結構被開發出來，骨長入使得機械固定變為生物固定[6]。Wang 等[15]測試了多孔鉭 - 細胞界面作用，他們使用的多孔鉭材料表面具有均勻分布且相互連接、直徑為 200～400 μm 的大孔，各大孔內部還具有粗糙的、直徑更小的 ( 50～200 μm ) 微孔結構，這種高粗糙度的“孔中帶孔”結構增加了細胞及骨組織接觸面積，利于吸收更多的大分子，促進細胞黏附，增殖和成骨能力，增加穩定性。

為了持久地發揮鉭良好的界面作用，維持鉭骨界面穩定極其重要。由于長期存在于人體內，在負載磨損過程中，涂層或金屬顆?？赡軙闹踩胛锉砻驷尫懦鰜聿⑴c局部細胞相互作用，導致復雜的局部細胞反應，進而可能影響骨形成與吸收之間的平衡[33-34]。多孔鉭內部相通的孔隙結構為金屬植入物脫落顆粒的遷移提供了通道，這意味著相當于異物的金屬脫落顆粒不會長久的“定居”在金屬植入物的周圍，將減少炎癥反應且可以避免植入物周圍的骨溶解，Rahbek 等[35]通過對比聚乙烯顆粒 ( polyethylene，PE ) 在植入犬膝關節中的多孔鉭與鈦合金周圍的遷移情況發現，鉭孔內具有更多的骨髓和少量的纖維組織以及一定數量的 PE 顆粒，周圍的 PE 顆粒則明顯少于鈦植入物；骨植入物界面處的振蕩壓力是影響骨組織、致骨細胞死亡、骨溶解的原因[36]，鉭植入物的多孔結構誘導的異物顆粒內移、骨組織向內生長會產生一種力正好分擔并減少了植入物表面壓力，稱之為“流體流動壓力”效應，正是這一分擔效應使得鉭植入物表面壓力不會升高到抑制骨形成或發生骨溶解的程度，從而發揮出比鈦植入物更好的生物相容性。

Kang 等[37]在體外培養液中加入源自于多孔鉭的納米鉭顆粒，模擬鉭在體內長期植入后的磨損顆粒，分別加入自噬誘導劑和抑制劑，觀察成骨細胞活力和自噬對細胞增殖的影響，結果發現納米鉭促進了成骨細胞的增殖；在使用納米鉭的基礎上，加用自噬誘導劑會進一步加強本來已經增強的細胞增殖作用，自噬抑制劑則會抑制這種增殖作用，而單獨使用自噬調節劑則不會對成骨細胞活性和增殖產生影響，說明鉭可以促進成骨細胞增殖并誘導“自噬”，而“自噬”可加強這種增殖作用。

5. 多孔鉭的骨整合與增值改建：骨植入物接觸指數 ( BIC 指數 ) 是描述植入物骨整合的常用指標[38-39]。作為關節假體，多孔鉭展現出較高的 BIC 指數，感染條件下，鉭良好的促骨細胞增殖、促骨長入、促骨組織分化的骨整合能力仍能保持。Wahl 等[40]報道了 1 例肱骨骨折內固定術后合并感染并進行肩關節多孔鉭假體置換術的修復情況，術后 3 年反復感染并伴瘺管形成，對回收的關節假體進行組織學研究發現，骨長入的 BIC 指數為 32.0%，骨組織向孔內生長和覆蓋鉭表面的范圍分別占相對骨面積的 8.2% 和 11.9%；在光鏡下看到鉭表面和孔內有新骨和骨髓的形成，鉭孔內有成骨細胞、多核巨細胞、新生血管以及纖維組織的廣泛存在，鉭所帶來的骨組織修復已處于較為成熟階段，雖然最終沒有完成感染情況下肩關節的修復，多孔鉭展現的骨整合作用卻為植入物的開發和術后并發癥的管理帶來新的機遇。Borland 等[41]報道了多孔鉭在髖臼骨缺損修復的臨床療效，使用多孔鉭增強器、自體細碎骨移植技術和骨水泥固定器對髖臼進行復雜重建并隨訪 3～ 7 年，患者普遍表達了極高的滿意度且影像學顯示鉭 - 髖臼組件傾斜度 ( ＜ 1° ) 、移位度 ( ＜ 5 mm ) 均正常范圍內，這極大地改善了移植材料早期無菌性松動的問題。

多孔鉭表面修飾的興起是激發鉭潛能的新手段，使多孔鉭界面作用和骨整合能力大大提高[42]，不同的修飾手段使鉭骨界面的微觀結構發生改建，產生“界面機械負荷”的力學作用[43]，這種力學信號刺激細胞基質蛋白完成成骨過程。不同的修飾物、修飾方式為鉭界面作用的研究提供了多種方向，甘洪全等[42]研究了不同濃度精氨酸 - 甘氨酸 - 天冬氨酸 ( Arg-Gly-Asp polypeptides，RGD ) 多肽修飾下的多孔鉭 - 成骨細胞復合材料界面作用，RGD 是細胞膜整合素受體與細胞外配體結合的識別位點，可促進細胞間黏附，結果發現成骨細胞形態改變并緊密黏附、鋪展、延伸至多孔鉭內部孔中，OCN、纖維連接蛋白 ( fibronectin，FN ) 及絲狀肌動蛋白 ( filamentous actin，F-actin ) 的表達均顯著增高且以 F-actin 的表達最強。F-actin 主要介導骨生成及骨重建，RGD 修飾下的成骨細胞 - 鉭界面產生力學負荷，促使 F-actin 的重組與表達，使細胞骨架發生改變及重組以調控成骨基因的表達，加快骨基質礦化速度，細胞增殖、代謝加速及 Ⅰ 型膠原表達增強[43-44]。與細胞黏附率、基質蛋白表達水平均顯著較低的未經 RGD 修飾的對照組比較，RGD 修飾的多孔鉭 - 細胞界面表現出更好的骨整合能力。

作為頗具潛力的生物植入材料，多孔鉭所具備的優秀的骨整合能力和界面特性越來越令人矚目。目前，多孔鉭已經在口腔頜面外科、骨外科、血管外科等臨床中投入使用，形成多種形態、不同功用產品系列，用于缺損重建、假體涂層或支架。但是由于價格昂貴、加工工藝復雜，其臨床使用率較低，與其優秀的生物學性能不相匹配。如何進一步提升鉭生物學性能，提高鉭 - 細胞 - 骨界面整合效率，促進鉭材料的增值利用，已經成為目前醫學融合研究的熱點和重點課題之一。