海洋假交替單胞菌生物膜產ROS特性研究

呂 菁 萍， 李 澤 龍， 張 鶴 睿， 王 競

( 大連理工大學 環境學院, 遼寧 大連 116024 )

0 引 言

目前，對于海洋產ROS細菌的研究僅集中在游離態菌體，生物膜形態對海洋產ROS細菌的影響鮮見報道．在實際海洋環境中，存在著大量可供微生物附著的載體，如海洋礁石、海洋甲殼動物、藻類殘骸以及由地質演化、大氣沉降、人類活動等形成的一些碳質顆粒物等[9]．而海洋微生物更傾向于在載體表面附著，并形成生物膜，這些生物膜往往在海洋環境中發揮著重要作用[10-11]，被認為是海洋環境中最普遍的生命形式[12-13]．以生物膜形式存在的微生物有著更廣泛的信息交流及更精密的調控機制，在生物活性等方面均有所提高[14]．因此，研究海洋細菌生物膜產ROS的特性可以加深對海洋無光環境中生物源ROS的了解．

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的海洋假交替單胞菌GCY從中國大連市黑石礁海域(北緯38°52′，東經121°33′)沉積物中分離并富集培養得到，在整個實驗過程中用到的均是純培養菌體．

實驗所用培養基均用人工海水配制[17]，并調節培養基初始pH至8．0左右．酵母浸粉培養基配方為酵母浸粉6 g·L-1；2216E培養基配方為酵母浸粉1 g·L-1，蛋白胨5 g·L-1．

本實驗選用泡沫炭載體作為碳質材料的代表，實驗所用藥品均購自阿拉丁化學試劑有限公司．

1.2 生物膜的培養及表征

1.2.1 生物膜的培養 生物膜的培養方法參照前人實驗，并在此基礎上作出了改進[18-19]．將泡沫炭剪成1 cm×1 cm×2 cm的小塊，用無菌人工海水清洗數次，并用烘箱烘干滅菌．將無菌炭塊固定在支架上，放置于裝有100 mL酵母浸粉培養基的250 mL錐形瓶中，將活化后的菌體接種到泡沫炭上．在恒溫搖床內培養96 h，得到穩定生物膜．

1.2.2 生物膜生物量的測定 載體上生物量的測定采用超聲分離法[19-20]，并加以改進：首先在無菌操作臺中，將掛膜后的泡沫炭取出，并輕輕沖洗以去掉弱吸附微生物，超聲預處理30 min將吸附于載體上的微生物轉到100 mL無菌生理鹽水中，然后通過紫外分光光度計在600 nm下檢測微生物量．依據干質量曲線換算可得膜上微生物干質量：

y=1.05x+0.240 04；R2=0.997

1.2.3 生物膜形貌表征 采用掃描電子顯微鏡(SEM)來對微生物生物膜的形貌與形態進行表征，樣品制備過程如下：用0.5 mol·L-1無菌PBS溶液洗滌生物膜2～3次，再使用2.5%戊二醛緩沖溶液(pH=7.2)固定24 h，用無菌PBS溶液清洗炭塊2～3次，加入不同質量分數的乙醇溶液(15%、30%、50%、70%、80%、90%和100%)梯度脫水，每個梯度預脫水處理15 min，再將樣品放入真空冷凍干燥箱里以40 ℃干燥3 h．干燥后的樣品固定在導電膠帶上進行噴金處理．在掃描電子顯微鏡下，觀察樣品表面的形貌與形態．

1.2.4 胞外聚合物的測定 使用堿提法，取10 mL 菌液，離心(10 000 r·min-1，20 min)后得到的上清液即為溶解態胞外聚合物(EPS)．再向沉淀中加入7.14 mL超純水和0.06 mL的36.5%甲醛溶液，反應1 h后再向體系中加入2.86 mL的1 mol·L-1NaOH溶液提取2 h，在10 000 r·min-1下離心分離20 min后將上清液過膜，即為結合態EPS．分別對兩組樣品中的多糖以及蛋白質進行測量．多糖測定使用苯酚-硫酸法，蛋白質測定使用考馬斯亮藍法．

1.3 ROS及相關酶的測定

為探究GCY生物膜與游離菌體GCY產ROS的差異，將GCY生物膜設為實驗組，游離菌體GCY為對照組，取胞外液測定其ROS產量，及L-氨基酸氧化酶(L-amino acid oxidase，LAAO)、鐵載體等胞外活性物質活性．對生物膜進行超聲剝落，與游離菌體進行對照，比較代謝相關酶的活性變化．

1.3.2 代謝活性的測定 脫氫酶活性(dehydrogenase activity，DHA)的檢測采用TTC法[24]．電子傳遞系統活性(electron transport system activity，ETSA)的檢測采用INT還原法[25-26]．

1.3.3 L-氨基酸氧化酶活性 向胞外液中加入等體積的5 g·L-1亮氨酸溶液作為反應底物，在25 ℃條件下反應30 min，測定反應前后H2O2濃度的差值，其差值即為30 min內產生的H2O2．

1.3.4 鐵載體 鐵載體的檢測使用鉻天青CAS法，將配制好的CAS檢測液與胞外液樣品等體積混勻后，于4 ℃下放置30 min，再使用紫外分光光度計在630 nm下測定吸光度．以酵母浸粉培養基作為空白對照，排除培養基成分的干擾．

2 結果與討論

2.1 生物膜的表征

菌株GCY為海洋假交替單胞菌，該菌屬的許多菌株已被證實具有形成生物膜的能力[27]．通過實驗，結合菌株干質量曲線計算可知單位體積泡沫炭上的微生物干質量為22 mg·cm-3，將制備好的樣品按照前文所述方法，使用SEM觀察其表面形貌．可以明顯看出，菌體與其分泌的胞外聚合物覆蓋在碳材料表面，生物膜系統趨于穩定(圖1)．

圖1 GCY生物膜SEM表征Fig.1 SEM observation of GCY biofilm

EPS是由微生物代謝所分泌的高分子聚合物，如蛋白質、多糖等．EPS將微生物包埋在絮體中，是微生物生物膜的重要組成．因此，對GCY生物膜及游離菌體GCY的EPS進行檢測．

多糖是具有黏性的大分子聚合物，在生物膜的形成過程中起重要作用．生物膜EPS和游離菌體EPS的多糖含量分別為313.55 mg·L-1及220.85 mg·L-1(圖2)，由此可以得出，碳質載體的存在會刺激微生物分泌多糖類物質，有助于微生物在碳質載體表面的初始黏附并形成穩定生物膜．蛋白質是EPS的重要組分，生物膜EPS及游離菌體EPS中蛋白質含量分別為310.41 mg·L-1及254.85 mg·L-1(圖2)．生物膜EPS中蛋白質含量的提升，暗示其可能具有更強的生物代謝活性．兩體系內EPS以結合態為主，均占到總EPS質量的90%以上．生物膜總EPS含量高于游離菌體，說明以生物膜形式生長的菌體具有更好的抵御外界不良環境的能力．

2.2 生物膜與游離菌體ROS產量

為探究生物膜與游離菌體的ROS產量差異，分別對兩體系內的ROS進行檢測．菌株GCY可以產生胞外H2O2，這一現象已被Gu等[8，17]報道．生物膜體系的H2O2產量總體上要高于游離菌體體系．有趣的是，GCY生物膜可以在菌株生長的對數期生成較高濃度的H2O2，在1 μmol·L-1以上，18 h以及24 h的生物膜體系H2O2產量可分別達到游離菌體體系的3.10倍和1.94倍(圖3)．而之前的研究往往在對數期末期或穩定期開始檢測到H2O2的生成[17，24]，生物膜的存在會使H2O2的產生提前．

圖2 生物膜及游離菌體EPS分泌Fig.2 EPS production of biofilm and free cells

圖3 菌株胞外H2O2產量Fig.3 The generation of extracellular H2O2

(a) 對數期

2.3 生物膜ROS形成機理分析

本課題組已經在GCY的基因組中發現了基因lodA，并證實了其編碼的L-氨基酸氧化酶參與了菌株GCY生成H2O2的過程[24]．因此，本實驗對胞外體系的L-氨基酸氧化酶酶活性(以H2O2為基準)進行測定．菌株GCY在生長的各個階段均檢測到L-氨基酸氧化酶酶活性，在穩定期48 h時，生物膜體系的L-氨基酸氧化酶酶活性可達游離菌體體系的1.33倍．值得注意的是，在對數期24 h 時，生物膜體系內也檢測到了較高的L-氨基酸氧化酶酶活性，這也解釋了生物膜體系中H2O2產生提前的原因(圖6)．

(a) 胞外?OH產量

圖6 L-氨基酸氧化酶活性Fig.6 L-amino acid oxidase activity

ETSA可以表示經氧化呼吸鏈傳遞給最終電子受體的電子數量，進而指示微生物的代謝活性．在菌株生長的整個階段，生物膜上微生物的ETSA 均要顯著高于游離菌體體系，最高可達游離菌體體系的1.74倍．可見，生物膜上微生物的代謝活性有所提高，尤其是呼吸鏈電子傳遞方面的代謝活性(圖7(a))．

(a) ETSA

3 結 語