生殖檢驗發展面臨的問題與挑戰*

陸金春（東南大學附屬中大醫院生殖醫學中心，南京210037）

生殖檢驗是醫學檢驗的一個分支，涉及多專業、多學科，其起源于醫學檢驗，服務于生殖醫學。生殖檢驗的早期檢驗項目為精液常規分析，在醫學檢驗科常不受重視。隨著男科學的發展，男科實驗室逐漸興起，精液檢查亦從精液常規分析拓展到精子形態學、免疫學、精子功能、精漿生化、生殖道感染、脫落細胞學、遺傳學檢查等。然而，生殖是夫妻雙方共同承擔的責任，女方的相關檢驗也應納入到生殖檢驗領域。因此，生殖檢驗的主要任務應是：運用物理學、化學、生物學、免疫學等學科知識，對育齡夫婦的血液、精液、陰道分泌物、胚胎培養液等標本進行實驗室檢查，以獲得病原學、病理學、生殖器官及配子（精子和卵子）和胚胎功能狀態等資料，結合病史、體格檢查和其他各種輔助診斷資料進行綜合分析，為男女生育力評估、男女生殖功能相關疾病的診斷及治療、輔助生殖技術的選擇以及配子和胚胎的選擇等提供依據，以達到使育齡夫婦正常妊娠的目的。

生殖檢驗的發展才剛起步，面臨的問題很多，甚至有些問題嚴重阻礙了生殖檢驗的正常發展。因此，生殖檢驗的發展面臨巨大挑戰，具體如下。

1 對生殖檢驗項目和場所設置缺乏了解

很多人認為，生殖檢驗就是精液分析，其實不然。精液分析只是生殖檢驗最基本的項目之一。生殖檢驗項目幾乎涉及醫學檢驗的各個方面，如生化、免疫、微生物、分子遺傳等。目前已在臨床上開展的生殖檢驗項目有：（1）精液常規分析。其不是單一檢測項目，而是一組通過理學和顯微鏡檢驗得到的綜合報告，包括精液顏色、氣味、體積、pH值、凝固與液化、黏稠度以及精子濃度與總數、精子活力分級與精子活動率等［1-3］，在精子活動率明顯降低時可增加精子存活率檢測。（2）精子形態學及精液脫落細胞學檢測。二者均需低速離心并洗滌標本、涂片、染色、形態觀察及結果分類，故可單獨或同時分析。（3）精漿生化指標檢測。包括精漿α葡糖苷酶、果糖、鋅、檸檬酸、酸性磷酸酶、γ谷氨酰轉肽酶、肉堿、尿酸及超氧化物歧化酶等。（4）生殖免疫項目。特指與生殖活動或生殖系統密切相關的自身抗體，如抗精子抗體、抗子宮內膜抗體、抗卵巢抗體、封閉抗體等。（5）精子功能分析。包括頂體完整率、頂體酶活性、自發和誘發頂體反應率、精子膜完整性、精子DNA完整性、精子乳酸脫氫酶C4活性、線粒體膜電位（MMP）、精子活性氧（ROS）、膜糖被等。（6）生殖道感染相關檢測。包括精液白細胞計數、游離彈性蛋白酶、精液細菌培養、前列腺按摩液檢查及細菌培養、陰道分泌物常規、生化及微生態、尿道分泌物細菌培養、各種病原體的抗體和核酸檢測等。（7）生殖激素測定。包括血清睪酮、游離睪酮、雌二醇、孕酮、泌乳素、卵泡刺激素、黃體生成素、抑制素B、抗苗勒管激素、性激素結合球蛋白等。（8）遺傳學檢測。包括外周血淋巴細胞染色體核型分析、Y染色體微缺失檢測、特定基因突變檢測、基因測序等。（9）其他，如精漿活性氧檢測、精子-倉鼠卵穿透試驗（SPA）、人卵透明帶結合試驗等。

對生殖檢驗項目缺乏了解，緣于生殖檢驗項目過于分散。目前的生殖檢驗項目多分散于醫療機構的不同科室，如生殖中心的檢驗室、男科實驗室、檢驗科、獨立實驗室等，致使檢驗過程、結果報告等難以規范，與臨床的溝通不到位，結果互認難以執行，檢驗結果對臨床的指導價值大打折扣，甚至導致誤診或漏診。究其原因，一是體制問題，許多生殖檢驗項目均設在醫療機構檢驗科，但這些項目又是檢驗科里最不受重視的，許多進行精液分析的檢驗科根本沒有取精室，從事精液分析的人員缺乏應有的專業培訓，發出的精液分析報告對男科或生殖科醫生來說毫無意義；二是利益驅使，隨著醫療機構藥物和耗材零差價的實施，檢驗項目成為各個科室獲取效益的重要途徑之一，不同科室不顧患者利益爭奪檢驗項目的事件時有發生，導致科室之間關系緊張、患者投訴增加，甚至發生醫療糾紛。面對這些問題，應一切以患者利益為中心，不同科室之間應加強溝通。鑒于生殖醫學的特殊性，其集婦科、男科、胚胎培養、檢驗和護理于一體，為育齡夫婦解決生育問題，許多醫療機構將生殖醫學中心從其他科室獨立出來，目的就是方便患者。同理，生殖檢驗項目集中在醫療機構生殖醫學中心生殖檢驗室檢測是最理想的情形；如果在檢驗科檢測，應成立專門的生殖檢驗室，加強人員培訓和與生殖專科醫生溝通，切實為生殖醫學中心服務。

2 生殖檢驗相關術語及檢驗項目急需規范

要使生殖檢驗專業規范、有序地發展，生殖檢驗相關術語的正確使用、選擇科學和合理的檢驗項目以及每個檢驗項目的規范化檢測是必要前提。

在各種文獻包括國內生殖醫學相關專業期刊中的文獻和臨床工作中，“無精癥”［4］、“精液密度”［5］、“精子密度”［6］、“精子總活力”［7］、“總活力百分率”［8］、“精子活率”［9］、“前向運動精子率”［5］、“精子前向運動率”［10］、“向前精子活力”［11］、“精子正常形態率”［8］、“正常精子形態率”［10］、“圓細胞數”［12］、“白細胞精子癥”［13］、“彈性硬蛋白酶”［14］等術語經常見到。“無精癥”是指無精子還是無精液？“精液密度”與“精子密度”代表的應是單位體積精液或精子的質量，與“精子濃度”的概念完全不同，可在文獻中混為一談；“精子活力”不是單一指標，而是分級指標，包括前向運動精子百分率、非前向運動精子百分率、不動精子百分率；“精子活率”是指精子活動率還是存活率？“前向運動精子率”、“精子前向運動率”、“向前精子活力”應為“前向運動精子百分率”；“精子正常形態率”和“正常精子形態率”應為“正常形態精子百分率”；精液中的脫落細胞基本為圓形，精液中的圓細胞包括生精細胞（精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞）、淋巴細胞、中性粒細胞、支持細胞、前列腺上皮細胞、精囊腺上皮細胞、尿道上皮細胞、附睪上皮細胞等，而文獻和臨床工作中常把“圓細胞”看作為“白細胞”，很容易導致誤診；“白細胞精子癥”和“彈性硬蛋白酶”應為“白細胞精液癥”、“彈性蛋白酶”更合適。除此之外，還有不少生殖檢驗相關術語包括檢測項目名稱等亦有待規范。

一些新的生殖檢驗項目不斷引入臨床，如精子ROS、精子頂體反應率、精子MMP等，還有一些生殖檢驗項目雖已在臨床應用一段時間，但近來臨床研究發現［3，15］，這些檢測項目的檢測原理或分析過程存在嚴重錯誤，如精子DNA碎片指數（DFI）的流式細胞術測定、精液彈性蛋白酶的ELISA檢測、尿液前列腺小體外泄蛋白（PSEP）的ELISA檢測等。因此，當一個新的或臨床上提出質疑的生殖檢驗項目在進入臨床常規應用前應進行充分的評估，一是檢測原理必須科學，得到公認或有充分的循證醫學證據；二是各項性能指標如正確度、精密度、分析范圍、分析靈敏度、分析特異性、空白測定、檢出限、干擾等，必須經過充分評估并符合要求；三是應根據臨床需求選擇診斷意義明確、敏感性和特異性高、影響因素少且操作相對簡便、費用合理的生殖檢驗項目，既要防止過度檢查，亦要防止檢驗不足。

生殖檢驗項目的選擇相對于檢驗科其他檢測項目有一個非常顯著的特點和難點，即同一個檢測項目有多種檢測方法，而不同檢測方法差異較大、可比性差，又因精液樣本的特殊性（量少，精子為活細胞，運輸和貯存困難），要對不同檢測方法進行多中心、隨機對照研究幾乎不可能。例如，用于精漿生化指標如果糖、α葡糖苷酶、檸檬酸等檢測的方法有手工、半自動和全自動法，它們的檢測原理不同，精漿成分的干擾亦不同，檢測結果亦有差異；用于精子頂體酶檢測的方法有精子精氨酸酰胺酶活性測定的手工法和全自動生化儀法、明膠法、固相N-α-苯甲酰-DL-精氨酸-ρ-硝酰基苯胺（BAPNA）法，它們的檢測原理、結果表示方法及參考區間均有顯著差異；用于精子DFI檢測的方法有精子染色質結構分析法（SCSA）、精子染色質擴散法（SCD）、脫氧核糖核酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法（TUNEL）、彗星試驗，它們的檢測原理不同，檢測流程和所用儀器設備相差較大，可參考區間卻未見比較分析；精液白細胞的染色方法有瑞吉染色法、過氧化物酶染色法、CD45單克隆抗體法等，它們檢測的目標細胞并不完全一致，反映的臨床意義亦有所不同。又如精子核成熟度的檢測，有精子核DNA熒光染色法、精子核染色質抗解聚試驗、精子核蛋白組型轉換試驗，三者反映的結果有何關聯？等等。對此，我們應該做的可能是：在檢測同一指標的不同檢測方法中，盡可能摒棄影響因素較多、臨床操作繁瑣、難以質控的方法，再將選定的當前最為科學、易操作和質控的方法進行規范并通過培訓、幫扶等手段推廣至全國各級醫療機構，同時盡可能開展室間質評，以達到結果互認的目的［16］；如果不同檢測方法的目標對象被進一步細分，應重新確定具體目標的臨床意義及參考區間。一旦某個檢測項目的方法被確定后，應對樣本留取與貯存、試劑準備、具體檢測過程、結果報告及質控等檢測全程進行規范，并結合實驗室實際情況書寫標準操作程序（SOP）文件，且臨床日常工作中嚴格按此文件操作。

3 絕大多數生殖檢驗項目缺乏有效的質控措施

在現有的生殖檢驗項目中，除了大多數生殖激素項目可參加省級或國家級臨床檢驗中心質量評價活動外，其他生殖檢驗項目中的一些雖有少數醫療機構或廠家在牽頭實施，但像臨床檢驗中心規范實施的質量評價項目極少。盡管生殖激素項目有相對規范的質控措施，但在實際臨床工作中，這樣的質控措施并不適合生殖醫學科的患者，因為進行輔助生殖技術的女性，促排卵藥物的使用可使雌二醇升高幾十倍甚至數百倍，女性一旦妊娠，血清孕酮和人絨毛膜促性腺激素（HCG）水平快速增加，尤其是HCG可增加上千倍甚至更高，這些指標對判斷女性卵泡的發育、妊娠結局很關鍵。對于未促排、未妊娠的育齡女性，這些激素的質控措施可保證檢測結果的準確性，但對于促排、已妊娠的女性，這些激素水平已遠遠超過它們的檢測范圍，樣本面臨著稀釋的問題，甚至要進行多次稀釋，從而導致檢測結果與臨床不符、檢測成本大幅上升、實驗室人員工作量劇增、生殖科醫生對生殖激素檢測結果缺乏信任、臨床矛盾出現。如何解決這種困境？使用金標準的質譜法，或帶有自動預稀釋功能的化學發光檢測系統，可能是未來發展方向；檢驗人員與臨床醫生的及時溝通十分關鍵，促排第幾天？胚胎種植多久？一個簡單的標識可以提醒檢驗人員合適的稀釋比例，生殖檢驗室置于生殖醫學科或在檢驗科成立專門的生殖檢驗室，將會有利于及時溝通。

盡管目前一些機構或廠家開展了部分生殖檢驗項目室間質評工作［17-19］，但仍存在諸多問題：一是質控品與實際檢測樣本差異較大，如精子形態學分析的質控經歷樣本的洗滌、涂片、染色及觀察，而目前的精子形態學質控品多為已染色玻片或者是染色的精子照片，失去了對精子洗滌、涂片和染色的控制，且觀察照片和觀察顯微鏡下的精子是完全不同的概念，精子大小不同且顯微鏡的微調對結果觀察影響很大。二是質控品和實際檢測樣本的檢測流程明顯不同，如精子活力質控使用的錄像帶法，其無法適用于現已常規使用的計算機輔助精液分析系統（CASA），只能以人工分析代替CASA分析，且其無法反映精液樣本混勻、計數池充池及充池后等待時間對檢測結果的影響；又如精子濃度的質控，要求根據WHO手冊使用血細胞計數板進行檢測，而實際工作中基本使用CASA分析精子濃度。三是絕大多數檢測項目仍缺乏有效的質控措施，如陰道分泌物檢測、精子DFI分析、生殖免疫項目、大多數精漿生化指標、精液白細胞測定、遺傳學檢測等。

針對上述問題，我們可以分兩個階段推進質控工作：首先建立有效的室內質控措施，一是加強操作技能培訓，建立標準化的操作流程，尤其是帶有主觀性的分析項目如精子形態學分析，應加強精子形態評估標準的統一；二是相對穩定的檢測項目如精漿果糖、鋅等，取一定量精漿樣本分裝后冷凍保存，每次常規檢測精漿樣本時取出一支作為室內質控品同批檢測；三是暫無有效室內質控品的計數項目如精子存活率檢測、精液白細胞計數等，可重復計數2次，2次計數的結果差異應在95%可信區間內；四是暫無有效室內質控品的儀器檢測項目如陰道分泌物的全自動檢測、封閉抗體的流式細胞儀檢測等，應定期進行空白測定，流式細胞儀還應用熒光微球進行儀器質控；五是盡可能將陽性樣本收集后冷凍保存，如抗精子抗體等檢測項目，可分裝后作為室內質控品。其次是建立生殖檢驗質控中心并逐步完善。先以比較成熟和容易開展的項目進行室間質評，如精子濃度、精漿生化等，待室間質評體系初步建立后，成熟一個室間質評項目就開展一個，最后形成相對完善的室間質評體系。生殖檢驗質控中心應相對獨立，所選質控品應能覆蓋檢驗全流程，能真正達到監測檢測體系的目的，而不應以質控名義推銷產品，以校準品替代質控品，甚至把試劑質控當作質控品宣傳，擾亂生殖檢驗市場。

4 新技術在生殖檢驗中的應用

最近幾年逐漸興起的一些新技術，如人工智能（AI）、微流控技術、串聯色譜質譜分析、無創基因檢測技術等將會逐漸應用到生殖檢驗領域，并可能對某些生殖檢驗項目的檢測方法帶來革命性的變革。

自2017年之后，人工智能在生殖醫學中的應用呈現快速增長趨勢［20］，幾乎涉及生殖醫學的各個方面，包括對精子形態學和精子活動率的分析、根據不染色精子三維結構及內容物的多個特征預言精子質量、評估卵母細胞或胚胎的質量預言囊胚形成率和活產率、建立最佳的促排卵方案等。基于精子影像識別的人工智能和云計算技術，已經開發出家用精子活動率檢測系統，并適用于不同類型的手機［21］；基于精子染色圖片的深度學習和大數據，已建立對不同精子形態的分類檢測系統［22］。人工智能在生殖檢驗領域的深入應用，必將革新目前的CASA。值得注意的是，人工智能并非萬能，在準備建立基于人工智能的精子檢測系統之前，建模非常關鍵，建模所用數據必須真實、可靠，必須是基于標準化、規范化基礎之上獲得的無可挑剔的數據，否則所建模型將會直接影響未來分析結果的準確性。

精子和卵子的制備、體外處理、優選、分析和冷凍等，亦是未來生殖檢驗發展的方向之一，而微流控技術因其使用樣本和試劑量少、分析快速、體積小便于攜帶、操作簡便、高度集成性、高通量、易于標準化和自動化以及微管道的靈活設計可以更好地模擬生理環境等，在生殖醫學領域備受歡迎［23-24］。微流控技術可用于單精子功能分析，精漿組分的檢測，精子活力、趨化性及趨溫性篩選，卵母細胞的篩選與體外成熟，卵丘細胞及透明帶的去除，早期胚胎培養，生殖器官如睪丸組織、子宮和卵巢微環境以及胎盤組織的仿生學研究，精子篩選、卵母細胞定位、受精、胚胎培養在微流控芯片上的整合，以及生殖細胞的冷凍保存等［25］。使用微流控技術時，材料的選擇很重要，必須對配子和胚胎無毒、安全。充分利用微流控芯片的集成優勢，建立微量全分析系統和體外精卵篩選-受精-胚胎培養整合系統可能是未來微流控技術在生殖醫學領域的重要研究方向。

隨著遺傳學檢測技術（尤其是測序技術）的發展，許多不明原因的不孕不育得以診斷。常見的不育相關的遺傳學檢測有染色體核型分析、Y染色體微缺失的檢測、特定基因或一組基因的突變檢測、基因多態性分析、非整倍體檢測、基因測序等，尤以非侵入性植入前遺傳學檢測（NIPT）備受關注。遺傳學檢測給大量患者帶來益處的同時，也面臨新的挑戰。不同的基因檢測技術均有其優勢和不足，故給遺傳學檢測報告的準確解讀帶來困難，如何避免錯誤解讀、過度解讀，是我們生殖檢驗人未來的必修課之一；許多遺傳學檢測的樣本來自醫療機構，檢測場所在公司或獨立實驗室，如何避免樣本運輸、保存帶來的影響，保證檢測過程在控，是未來研究課題之一；植入前遺傳學檢測（PGT）對胚胎有創、活檢技術要求高、花費較大、嵌合體可能帶來誤診或漏診且面臨倫理問題，給NIPT提供了市場，NIPT可避免損傷胚胎、無需特殊活檢技術、花費少、有適宜遺傳學分析的DNA模板等優勢，但其DNA量少、質量差、易受精子或母體DNA污染等問題同樣會帶來誤診或漏診，NIPT和PGT結果之間的一致性報道差異較大，且兩者均缺乏廣泛認可的最佳標準操作程序［26，27］。可以說，遺傳學檢測的未來應以規范和質控為主。

質譜技術因其高靈敏度、高特異性、能夠多組分同時分析等特點，適用于復雜生物基質中生物標志物的定量分析，可用于精漿組分、卵泡液及胚胎培養液中微量組分、代謝組分等的分析［28-29］。但由于質譜儀價格昂貴、自動化程度相對較低、對技術人員依賴性較大、所需標準物質和耗材主要依賴于進口、方法標準化難以實施，質譜技術在生殖檢驗中普及尚待時日。但隨著技術的不斷革新和發展、更多臨床檢驗專業人員的重視和參與，質譜技術有望像免疫學方法和化學發光技術一樣，成為生殖檢驗的重要檢測平臺之一。

總之，生殖檢驗作為醫學檢驗的一部分，既有醫學檢驗的共性特點——檢驗操作的自動化、檢驗方法的標準化、檢驗技術的現代化、檢驗試劑的商品化、計量單位的國際化、質量管理的全程化、生物安全的嚴格化、檢驗人員的合格化［30］，亦有生殖檢驗的特殊性——研究對象為活細胞，更多的是細胞功能的檢測。生殖檢驗的特殊性決定了質控措施實施的艱巨性，但只要我們積極開動腦筋，腳踏實地地做好每一步，密切關注可能應用到生殖檢驗領域的新技術，生殖檢驗的發展一定會越來越好。