外陰陰道念珠菌病患者白念珠菌分離情況及ERG5基因位點突變分析

金蕾，史偉峰（.無錫市婦幼保健院檢驗科，江蘇無錫4000；.蘇州大學附屬第三醫院檢驗科，江蘇常州3000）

外陰陰道念珠菌?。╲ulvovaginal candidiasis，VVC）是一種臨床常見婦科疾病，感染率僅次于細菌性陰道炎，極大地影響婦女生殖健康［1］。白念珠菌是該病常見的致病菌，感染率約為80%［2］。唑類藥物是目前臨床治療VVC的首選藥［3］，但隨著唑類藥物的廣泛使用，耐藥菌株日益增多。減少以及預防耐藥株的出現，已經成為醫學領域的研究熱點。唑類藥物通過抑制14-α去甲基酶，從而抑制麥角甾醇合成，破壞真菌細胞膜，從而發揮抗真菌作用［4］。目前，麥角甾醇合成通路中活性藥物靶酶基因Ergosterol（簡稱ERG）的突變或者高表達，被認為是白念珠菌耐唑類藥物的主要機制之一［5］。本研究旨在了解VVC患者白念珠菌的檢出情況，并探究唑類藥物耐藥率及ERG5基因突變情況，為臨床抗真菌藥物的選擇提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象及菌株 收集無錫市婦幼保健院2018年6—12月婦產科門診VVC患者陰道分泌物共500例，患者年齡25～49歲?；颊吲R床癥狀為外陰紅腫瘙癢，分泌物增多，并且呈白色豆腐渣樣。白念珠菌ATCC 10231購自于鄭州安圖生物公司。

1.2 主要儀器與試劑 PCR儀（美國ABI公司）；凝膠成像儀（上海復日科技公司）；電泳儀、電泳槽（北京六一儀器廠）；質譜儀（德國布魯克公司）；真菌快速培養鑒定藥敏試劑盒（鄭州安圖生物公司）；dNTP、10×PCR Buffer（含Mg2+）、Taq Plus DNA聚合酶、Ezup柱式基因組DNA抽取試劑盒、B600090 PCR擴增試劑盒（上海生工生物工程公司）。

1.3 真菌鏡檢及培養 將采集的陰道分泌物標本均勻涂抹于載玻片上，滴加50μL 10%KOH溶液，蓋上蓋玻片，加熱固定，冷卻后在顯微鏡下觀察標本有無菌絲或者孢子。將鏡下見菌絲或孢子的樣本接種沙保弱瓊脂平板，35℃培養24～48 h，若平板上呈現乳白色或者淡黃色、表面光滑濕潤呈奶油狀菌落，可以初步判斷為念珠菌屬。

1.4 真菌鑒定及藥敏試驗 挑取念珠菌屬單個菌落，轉種于科瑪嘉顯色培養基，35℃培養24～48 h，進行初步鑒定。對于翠綠色菌落采用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）鑒定：滴加70%甲酸溶液1μL至靶板，取少量待測菌均勻涂抹，干燥后滴加1μL基質溶液，采用Microflex質譜儀進行鑒定。依據儀器說明書進行結果判讀。采用真菌快速培養鑒定藥敏試劑盒進行藥敏試驗，依據說明書進行操作及藥敏結果判讀。

1.5 基因擴增及測序 采用Ezup柱式基因組DNA抽取試劑盒從目的菌株中提取DNA，經PCR擴增試劑盒對ERG5基因進行擴增。用Primer Premier 5軟件設計引物，引物序列F：5′-ATGAATT CAACAGAGGTCGATAA-3′；R：5′-CTATAAACTCT TTAATGGGTCTCT-3′，由上海生工生物公司合成。PCR擴增反應總體積50μL，包括模板DNA 2μL，上、下游引物（10μmol/L）各2μL，dNTP 2μL，Taq酶1μL，10×PCR Buffer 5μL，ddH2O 36μL。擴增反應參數：95℃5 min；94℃30 s，60℃30 s，72℃50 s，35個循環；72℃5 min。取PCR產物5μL經10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察，目的條帶切膠回收后送至上海生工生物工程公司進行雙向測序。PCR測序反應總體積20μL：純化的PCR產物（10 ng/μL）1μL，2.5×BigDye 4μL，5×BigDye Seq Buffer 2μL，3.2 pmol/μL測序引物1μL，滅菌去離子水12μL。在美國ABI公司3730XL測序儀上按以下條件反應：96℃1 min；96℃10 s，50℃5 s，60℃4 min，25個循環；4℃5 min。所得DNA片段測序長度512 bp。將序列與GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的標準序列比對，通過BLAST軟件分析，尋找突變位點。

2 結果

2.1 菌種分布 500例VVC患者陰道分泌物中313例鏡下可見菌絲或孢子，其中285例檢出念珠菌菌屬，經顯色培養基鑒定，白念珠菌占比最高，為54.7%（156株），其次為光滑念珠菌22.5%（64株），熱帶念珠菌16.5%（47株），克柔念珠菌4.2%（12株），其他真菌2.1%（6株）。156株經顯色培養鑒定為白念珠菌的菌株經質譜鑒定為白念珠菌（評分＞1.8）155株，余1株評分1.685分。

2.2 藥敏結果 155株白念珠菌菌株對5-氟尿嘧啶均敏感，2株菌株對制霉菌素耐藥（耐藥率1.2%），67株對酮康唑耐藥（耐藥率43.2%），97株對氟康唑耐藥（耐藥率62.5%），80株對酮康唑耐藥（耐藥率51.6%）。

2.3 測序分析 選取3株對多種唑類藥物（氟康唑、酮康唑、咪康唑）耐藥菌株（編號分別為CA21、CA73、CA81）、3株對唑類藥物均敏感菌株（編號分別為CA17、CA33、CA90）以及1株質控菌株ATCC 10231進行ERG5擴增后測序。將測序序列與已知基因序列（NC_032095.1）進行比對和分析，在敏感菌株CA33檢出1個同義突變位點G528A（176位氨基酸谷氨酸無變化），在耐藥菌株CA81檢出1個錯義突變位點G528C（176位氨基酸谷氨酸突變為天冬氨酸）。見圖1。

圖1 CA81菌株堿基突變位點

3 討論

本研究500例VVC患者陰道分泌物中313例鏡下可見菌絲或孢子，其中285例檢出念珠菌菌屬，其余28例檢出酵母菌類菌屬，從285例標本中分離出菌種分布以白念珠菌為主（54.7%），其次為光滑念珠菌（22.5%）、熱帶念珠菌（16.5%）、克柔念珠菌（4.2%）和其他真菌（2.1%）。非白念珠菌比例為45.3%，稍低于國外文獻報道的46.8%～68.9%［6］，可能與菌種地域性差異有關［7］。經涂片鏡檢結合顯色培養基可實現常見念珠菌的快速鑒定，本文采用該模式實現285例樣本的檢測，而對于白念珠菌的顯色鑒定亦經過質譜技術進行復核，雖然存在1株質譜鑒定低分值菌株，但仍具有較高的鑒定一致率。

Martel等［8］發現1株耐唑類抗真菌藥物白念珠菌菌株同時存在ERG5和ERG11基因雙重突變。有研究提出ERG5基因突變可能導致了麥角甾醇合成途徑受阻，使白念珠菌菌株對唑類抗真菌藥物產生耐藥性［9］。本研究結果顯示白念珠菌臨床敏感株和耐藥株的ERG5基因均存在突變，其中編號為CA33的敏感株，發生了1個同義點突變，位點為528 bp，突變前堿基所在的密碼子為GAG，編碼的氨基酸為谷氨酸（Glu），突變后未引起氨基酸的變化；編號為CA81的耐藥株，發生了1個錯義點突變，使其第528位堿基由G突變為C，發生了氨基酸置換，導致第176位氨基酸由谷氨酸（Glu）變成了天冬氨酸（Asp）。第528號位點是較容易突變的位點，耐藥菌株在該位點發生了錯義突變，引起了氨基酸的置換，提示與耐藥的產生有關［10］。

但白念珠菌對唑類抗真菌藥物的耐藥機制比較復雜，有可能是某種關鍵基因突變或者高表達導致菌株產生耐藥性，也可能是多種機制共同作用的結果。本研究進行測序的菌株有限，因此后期將增加測序的菌株，深入研究ERG5基因突變與真菌藥物關系，為治療白念珠菌珠菌感染提供一定的理論依據。