A型和AB型紅細胞表面A抗原類型調查*

趙媛，李代紅，劉偉，劉純，艾麗萍（.天津市第一中心醫院輸血科，天津3009；.天津市秀鵬生物技術開發有限公司，天津30039）

ABO抗原系統是人類最重要的血型系統，與輸血安全和器官移植等密切相關。非ABO同型輸血可能導致急性溶血反應、遲發性溶血反應、輸血無效等嚴重后果。除了正常的ABO血型外，還存在著由于基因突變引起的ABO亞型，包括A2和A2B的A2亞型是最常見的ABO亞型。為探討開展分子生物學方法檢測A2抗原的必要性，本研究主要調查ABO血型正反定型相符的A和AB型患者紅細胞表面A抗原類型。

1 材料與方法

1.1 研究對象 天津市第一中心醫院2020年1月至8月ABO血型檢測中，正反定型相符A型和AB型的患者3 024例，男1 467例，女1 557例。患者年齡1～97歲，成人2 543例，兒童481例。分子生物學確定A2和A2B血型的輸血患者作為觀察組，臨床診斷為同病種且當日輸血的患者作為對照組，排除外科失血＞50 mL或嚴重感染患者。每輸入2 U懸浮紅細胞，輸血后24 h內血紅蛋白（Hb）升高≥10 g/L視為輸血有效。

1.2 主要儀器與試劑 2005-1型離心機（珠海貝索公司）；X-15R型離心機（美國貝克曼庫爾特公司）；Erytra全自動血型配血儀（西班牙戴安娜公司）；DDY-Ⅲ2型電泳儀（北京六一生物科技公司）；ALPHAImager-EP凝膠成像分析儀（美國阿爾法公司）；AB9700PCR儀、ABI3730基因測序儀（美國Applied Biosystems公司）。

微柱凝膠血型卡（西班牙戴安娜公司）；雙花扁豆植物凝集素抗A1（荷蘭Sanquin公司）；DNA提取試劑盒（北京天根生化公司）；ABO-SSP試劑盒、ABO基因擴增與測序引物（天津秀鵬生物科技公司）。

1.3 標本采集與處理

1.3.1 血清學檢測 用EDTA-K2抗凝血標本進行ABO正反定型、A1抗原檢測，按照《AABB技術手冊》（第18版）［1］嚴格操作。

1.3.2 分子生物學檢測 抗A1陰性標本嚴格按照DNA提取試劑盒說明書提取DNA，調整DNA濃度30～50 ng/μL，A260nm/A280nm為1.6～2.0。用人類ABO血型基因分型檢測試劑盒進行PCR-SSP基因分型，110μL dNTP-Buffer工作液、0.9μL Taq酶（5 units/μL）、10μL DNA組成混合液，采用10μL作為反應體系。PCR產物進行25 g/L瓊脂糖凝膠電泳并用紫外凝膠成像分析儀觀察結果。同時委托天津市秀鵬生物技術公司用基因測序儀對ABO基因第1～7外顯子測序，擴增引物序列為5′-GCTG CCTCTGGAAGGGTGGT-3′和5′-ACCAAGGGCGGGA GGGG-3′。PCR反應條件：96℃預變性120 s；96℃變性20 s，68℃退火60 s，循環5次；96℃變性20 s，65℃退火45 s，72℃延伸30 s，循環10次；96℃變性20 s，62℃退火45 s，72℃延伸30 s，循環15次；72℃延伸180 s。擴增產物純化：37℃20 min，80℃20 min，4℃保存。結果由Chro-mas 2.31軟件進行序列分析。

1.4 統計學分析 用SPSS 20.0統計學軟件進行。Tmin≥5，N≥40時使用卡方檢驗；1≤Tmin＜5，N≥40時用校正卡方檢驗；Tmin＜1或N＜40時用Fisher精確檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 血型結果 3 024例正反定型相符A和AB型中，血清學檢出A2和A2B 48例（1.59%）。618例AB型中血清學檢出A2B血型32例（5.18%），2 406例A型中血清學檢出A2血型16例（0.67%），差異有統計學意義（χ2=64.1，P＜0.01）。

根據PCR-SSP與基因測序結果，共確認A2和A2B 16例（0.53%），PCR-SSP結果（圖1）與基因測序結果（圖2）相符。基因型：5例A102/O01，2例A102/O02，2 例 A101/B101，23 例 A102/B101，1 例A201/O01，3例A205/O01，2例A205/O02，2例A201/B101，8例A205/B101。16例A2基因中A205（81.25%）發生頻率高于A201（18.75%）。A2B血型檢出10例（1.62%），高于A2血型檢出6例（0.25%），差異有統計學意義（χ2=15.0，P＜0.01）。A2及A2B表型和基因型發生頻率與2013年的一項針對中國人群血型調查［2］對比，差異無統計學意義（P＞0.05）（表2）。

圖1 部分A2和A2 B血型PCR-SSP電泳結果

圖2 A201、A 205基因型部分測序結果

表1 中國人群A2和A2 B發生頻率比對結果

2.2 輸血情況 16例A2（A2B）患者中有11例接受輸血治療，輸注懸浮紅細胞共31.5 U，經檢測獻血員血液A1抗原全部陽性。5例（45.45%）發生輸血不良反應，其中2例（A201/B101、A205/O02）發生遲發性血清學反應均為輸血后9～13 d血漿中檢出抗A1抗體；3例發生輸血無效（27.27%）。當日同病種輸血患者23例，2例（8.69%）發生輸血不良反應，2例發生輸血無效（8.69%）。輸血不良反應發生情況差異有統計學意義（P＜0.01）；輸血有效率低于當日同病種輸血患者，但差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

A2和A2B血型是ABO系統最常見亞型，國內外研究顯示正確檢測A2和A2B血型有利于提高器官移植安全［3-4］和臨床輸血安全［5-7］。血清學AB型人群中A2B發生率高于A型人群中A2發生率，已有報道中［8-10］同樣存在此種與孟德爾遺傳規律不符的不平衡現象。A1和A2血型的A抗原存在數量上的差異，每一個紅細胞表面A抗原數量通常是：A1，8×105～12×105；A2，1×105～4×105；A1B，5×105～9×105；A2B，1×105［11］。目前臨床上通常依賴于限定外源性植物凝集素抗A1濃度檢測紅細胞表面A抗原數量來區分A1和A2血型。因此，推測由于AB型紅細胞表面A抗原數量低于A型紅細胞，使A2B血型更易被血清學方法檢出。

本研究PCR-SSP方法與基因測序結果一致，A2基因發生率0.53%與近年報道［6，12-13］相符，顯示中國人群A2基因并非罕見。本研究共檢出A205基因型13例，A201基因型3例，未檢出A2其他基因型；與中國其他地區的研究結果相符［2，14］。本研究顯示A2與A2B基因型發生率同樣存在不平衡現象，有研究認為這一不平衡是由于人群中A204基因型的存在導致［15］，但本次研究并未涉及該基因型。啟動子甲基化、反義RNA、組織特異性轉錄因子結合蛋白、外顯子1上游4 kb的小衛星增強區等因素都可能參與ABO血型基因調控［1］，對基因頻率的影響有待進一步研究。

本研究中發生輸血不良反應的A2和A2B血型患者遲發性血清學反應占40%，高于該類型在整體人群中的發生頻率。普遍認為A201是針對A1抗原產生抗A1抗體的最主要A2基因型，但本次發現的輸血病例中A205也會產生抗A1抗體。本研究中輸血治療效果以24 h內Hb為判定標準，輸血有效率未發現統計學意義，受判定標準局限和臨床干擾因素影響無法對輸血24 h后效果繼續評價，對遲發型血清學反應對輸血治療效果的影響有待今后繼續研究。

通過本研究發現，中國人群中存在一定比例的A2和A2B血型，PCR-SSP方法可以準確鑒定血型基因型，輸血前準確鑒定A2和A2B血型有利于提高臨床輸血安全。