DNA甲基化在癲癇演變和進展中的作用

汪智華綜述 林志國審校

癲癇是一種常見的神經系統疾病，具有發作性、短暫性、重復性和刻板性的特點。癲癇的發病機制至今不明，對癲癇發病機制的研究可以提高對癲癇的認識，并更好地指導臨床診斷和治療。表觀遺傳機制是調節基因表達的一種方式，其中DNA甲基化是一種主要的表觀遺傳修飾。本文就近年來DNA甲基化在癲癇演變和進展中的作用進行綜述。

1 DNA甲基化概述

DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的作用下，以S-腺苷甲硫氨酸為甲基供體，在胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤（cytosinephosphate-guanine，CpG）二核苷酸的胞嘧啶5'碳位由共價鍵結合一個甲基基團。DNA甲基化通過DNMT實現。DNMT包括在發育早期階段負責基因重新甲基化的DNMT-3a、DNMT-3b，以及維持既定甲基化模式的DNMT-1[1]。DNA甲基化位點通常集中在基因的啟動子區域內，但也可以在基因的其他位點，可以根據位點和募集的因子促進或抑制基因表達[2]。DNA甲基化改變了DNA的表觀和結構，可直接阻礙DNA的識別及與轉錄因子的結合，或者吸引其他因子優先與DNA結合干擾轉錄因子的結合，從而使基因的轉錄抑制或沉默。DNA甲基化是動態的，可通過某些酶的作用對DNA殘基中甲基進行修飾或去除[3]。DNA甲基化的可逆性為使用去甲基化制劑治療人類疾病提供了理論基礎。

2 DNA甲基化與癲癇

近年的研究為異常DNA甲基化和癲癇之間的關系提供了一些證據。Belhedi等[4]研究表明在局灶性癲癇和熱性驚厥（febrile seizures，FS）中CPA6啟動子甲基化增加。動物實驗研究發現癲癇持續1 d后，近300個基因出現低甲基化[5]。Li等[6]使用熒光素酶測定和CpG甲基化，發現丙戊酸（valproic acid，VPA）可通過誘導鈉通道Scn3a基因啟動子-39C位點甲基化，降低啟動子活性，產生抗癲癇作用，表明CpG甲基化在癲癇中的重要作用。更有研究表明，DNA甲基化失調是癲癇的原因，而不是癲癇的結果[7]。

3 與癲癇相關常見的基因甲基化

3.1 RASgrf1基因甲基化與癲癇RASgrf1，即Ras-鳥嘌呤核苷酸釋放因子1，是一種父系印記基因，其啟動子具有差異甲基化區域，可以使基因表達沉默。Chen等[8]使用紅藻氨酸（kainate，KA）致癇小鼠的動物模型研究RASgrf1啟動子甲基化水平隨癲癇進展的動態變化，發現RASgrf1啟動子甲基化在急性發作期后逐漸增加，并在潛伏期達到最大值，隨后抑制RASgrf1 mRNA和蛋白表達，在慢性期達到最低水平。RG108，一種DNMT抑制劑，可抑制RASgrf1基因甲基化的增加，使RASgrf1基因甲基化在潛伏期被顯著抑制，并在慢性期恢復正常表達水平。RG108可能通過調節神經元興奮性，抑制KA致癇小鼠的急性癲癇發作，而且心室注射RG108干擾潛伏期，可觀察到慢性期自發性復發性癲癇發作小鼠數量顯著減少，表明RG108可以改變癲癇的進展并防止KA誘導的癲癇小鼠發展成慢性癲癇[9]。這提示對RASgrf1基因甲基化的進一步研究有望闡明癲癇急性發作，急性期向慢性期轉變或癲癇復發性特點的機制，并有望發現新的基因治療靶點，終止癲癇急性發作及其復發。

3.2 青少年肌陣攣性癲癇（juvenile myoclonic epilepsy，JME）相關基因甲基化JME是以肌陣攣、全身強直-陣攣發作、失神發作為特征的遺傳性全身性癲癇綜合征，占所有癲癇的5%～10%，占特發性全身性癲癇的18%[10]。最近，Santos等[11]借助PRISMA指南對JME遺傳關聯進行系統評價，認為編碼含溴結構域蛋白2（bromodomain-containing protein 2，BRD2）的基因是JME一種重要的致病基因。隨后，Pathak等[12]研究表明BRD2基因啟動子甲基化與高加索人的JME有關。Schulz等[13]基于相同的JME診斷標準和實驗對象招募計劃，卻得出完全相反的結論，認為目前的研究結果不支持先前研究中強調的BRD2基因是JME的致病基因。

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是中樞神經系統的主要抑制性神經遞質，使膜電位超極化，降低神經元的興奮性，有助于維持正常腦功能并防止癲癇發作。研究指出，GABA能系統在介導神經元可塑性以及調節神經元興奮性方面發揮重要作用[14]。由GABA-A型 受 體（GABA A receptor,GABAAR）活化介導的突觸后抑制，通過陽離子-氯化物協同轉運蛋白（cation-Cl-cotransporter，CCC）實現，包括鈉-鉀-氯協同轉運蛋白1（NA--K--Clcotransporter 1，NKCC1）和鉀-氯協同轉運蛋白2（K--Cl-cotransporter 2，KCC2），通過調節細胞內Cl-濃度，維持神經元Cl-穩態，調控神經元功能[15]。最新的研究[16]通過比較JME與健康對照組的DNA甲基化狀態，研究NKCC1和KCC2在JME中的潛在作用，結果顯示JME病人NKCC1基因甲基化水平顯著降低，而KCC2基因甲基化水平顯著升高。這提示JME病人NKCC1呈高表達，KCC2則呈低表達。由于NKCC1和KCC2表達失調引起的神經元內外Cl-濃度差，可能弱化GABAAR介導的神經元興奮性抑制作用，到一定程度后，又可能引起神經元過度興奮，即從超極化效應向去極化效應的轉變，導致癲癇發作。

3.3 RELN基因甲基化與癲癇RELN基因位于7號染色體長臂區域，蛋白產物Reelin在中樞神經系統的發育過程中發揮著重要作用。Reelin是由Cajal-Retzius細胞合成的細胞外基質蛋白，在哺乳動物大腦的早期發育中，可作為神經細胞遷移終止信號調節神經元的遷移和定位，誘導大腦層狀結構形成。而在成熟的腦組織中，Reelin蛋白可以調節神經元突觸的功能，以及參與大腦層狀結構的維持。記憶主要存儲在大腦皮層，并與海馬結構及腦內化學成分的變化有關。FS是幼兒癲癇發作的最常見類型。Dai等[17]研究發現，RELN基因的高甲基化與FS記憶缺陷有關，并且這種記憶缺陷具有以下特點：①可跨代遺傳，幼鼠長時間FS發作可導致成年后記憶缺陷，這種記憶缺陷可由曾在幼年時期經歷過長時間FS的母鼠通過基因傳遞給子代；②可逆轉性，DNMT活性是這種記憶缺陷所必需的，DNA甲基化有助于FS誘導的記憶缺陷的跨代傳遞，DNMT抑制劑可抑制DNMT-1的高表達和RELN基因的高甲基化，并逆轉跨代記憶缺陷；③可挽救性，早期豐富環境治療可以挽救年幼時FS引起的成年期記憶缺陷，由于DNMT抑制劑對嬰幼兒有不可預測的副作用，此時環境治療更能體現出其安全性和有效性。

3.4 腦源性神經營養因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）基因甲基化與癲癇BDNF是在腦內合成的一種蛋白質，廣泛分布于中樞神經系統，對神經細胞有著廣泛的營養和保護作用。BDNF能促進苔蘚纖維出芽，建立新的突觸連接，其高表達能導致癲癇發作[18]。顳葉癲癇（temporal lobe epilepsy，TLE）是成人和青少年最常見的難治性癲癇，通常伴有不同程度的記憶障礙，潛在分子機制尚不清楚。研究指出，海馬注射BDNF可增加癲癇發作[19]，在記憶形成期間，海馬BDNF基因轉錄受DNA甲基化機制調控[20]，并且BDNF甲基化在癲癇模型海馬中受到異常調節[21]。這提示BDNF過表達可能通過增加皮質活動和癲癇易感性而導致記憶缺陷。近期的研究還指出發作間期棘波活動和θ頻率振蕩是導致癲癇記憶障礙的原因[22]。Parrish等[23]使用KA誘導的TLE小鼠，通過亞硫酸氫鹽測序的方法，證實在記憶鞏固期BDNF基因甲基化水平降低與癲癇海馬異常高水平的BDNF mRNA強烈相關；用甲硫氨酸（Met）補充甲基，可增加BDNF基因甲基化，在記憶鞏固過程中降低海馬BDNF mRNA的水平；同時，腦電圖顯示，發作間期棘波活動減少，θ節律能力增加。這表明異常DNA甲基化介導基因轉錄與TLE相關的記憶缺陷密切相關，通過Met補充甲基可能逆轉海馬依賴性記憶缺陷。但是Met以何種更安全有效的方式補充以及量的確定仍有待進一步研究。

綜上所述，癲癇演變和進展的一個主要假設是基因轉錄和蛋白質表達的大規模變化導致異常的網絡重組和過度興奮，導致癲癇發作反復發生。DNA甲基化引起的基因轉錄和蛋白質表達的異常改變，可能在癲癇異常網絡形成或重組中起作用，癲癇相關基因甲基化的研究作為一個新的領域具有廣泛前景，有助于了解癲癇機制，并根據特定基因位點的甲基化改變定制特定的甲基化調節劑，以抑制或增強癲癇相關基因的甲基化，從而更好地治療癲癇，使手術作為一個補充應用于極少數藥物難治性癲癇。