腰椎椎間盤退行性變動物模型建立方法的研究進展

姚明鶴，陳家磊

1.四川大學華西臨床醫學院，成都 610041 2.四川大學華西醫院骨科，成都 610041

腰痛是目前全球首位致殘疾病，給患者、家庭和社會造成極大的痛苦和沉重的負擔。與增齡有關的椎間盤退行性變（IDD）是腰痛的最主要原因。隨著工作與生活節奏的加快，IDD呈現年輕化的趨勢。建立符合IDD規律、成功率高、可重復性好、操作簡單、成本低且適合醫學研究的IDD動物模型，對明確腰椎IDD的發生機制及開展防治工作具有一定意義。目前的腰椎IDD動物模型大致可分為自發模型、損傷模型和生物力學模型等，本文依據以上分類作如下綜述。

1 自發模型

自發模型包括自然自發和誘導自發。自然自發模型是指不經特殊處理，實驗動物在成長發育過程中自然發生與人類相似的IDD，這種模型可避免人為操作因素的干擾，但只有沙鼠、恒河猴、犬及狒狒等少數動物可滿足條件。學者們在研究模型制備方法的同時也在不斷擴大實驗動物的選擇范圍，并發現豚鼠椎間盤的形態學及隨年齡增加其髓核內蛋白多糖減少的規律與人類相似，將其作為動物模型可較客觀地模擬自然自發IDD過程［1］。常用于基因相關研究的SM/J小鼠，可較早表現出典型的IDD特征［2］。但這些特殊動物之間性狀差異明顯，退行性變程度不可控，用于治療研究可信度差，多用于IDD發生機制的研究。從而誘導自發模型是通過基因技術敲除實驗動物的特定基因，造成椎間盤特定成分合成、代謝異常，誘導IDD發生。Chsy3基因敲除小鼠模型誘發的IDD進程相對較緩，應用于IDD的研究更有優勢［3］?；蚯贸Ｐ妥C明了基因、遺傳因素對IDD的影響，適用于發生機制、藥物作用靶點基因層次的研究，但模型均只涉及某一特定基因，造成的影響很局限；另外，其實驗條件要求高、操作復雜、成本高，不適宜作為工具模型大量使用。另有藥物誘導自發模型，通過向實驗動物體內注射D-半乳糖，造成代謝異常，引起各器官受損、系統功能衰退等變化，使椎間盤的結構、生理狀況發生變化，促成椎間盤衰老［4］。

2 損傷模型

2.1 髓核損傷

損傷髓核方式大體上可分為物理損傷和化學損傷。物理損傷主要是通過髓核摘除或髓核穿刺并抽吸/旋切的方法建立模型。Shi等［5］在顯微鏡下使用微型手術刀摘除小鼠椎間盤髓核成功建立模型。用較粗的針頭穿刺兔纖維環并抽取髓核［6-7］、施加負壓［8］或用針尖旋切髓核組織［9］等方式均可成功建立模型。為保持纖維環完整性，可經椎弓根切除部分髓核來建立IDD模型［10］，但有學者認為，此類模型為IDD導致脊柱不穩，而非脊柱不穩造成IDD［11］。

化學損傷是將木瓜凝乳蛋白酶、軟骨素酶ABC、纖連蛋白片段（Fn-f）等化學物質注入椎間盤內［12-14］，引起髓核細胞變性、消融，導致IDD。實驗研究［12］表明，兔腰椎IDD程度隨木瓜凝乳蛋白酶注射量增加而加重。將軟骨素酶ABC注入大鼠Co7/Co8椎間盤，可以成功建立模型［13］。將軟骨酶ABC注入山羊椎間盤可引起IDD，且退行性變程度隨注射劑量增加而加重［15］。將Fn-f注入兔腰椎椎間盤中心，組織學證據顯示，8周時椎間盤開始發生退行性變，分別于8、12周時，聚集蛋白聚糖mRNA、Ⅱ型膠原mRNA表達程度低于對照組［14］。但化學損傷，其注入量控制困難，建模效果不穩定，且穿刺部位易形成骨贅，化學物質會導致椎間盤組織代謝異常，對藥物的作用效果及后期檢驗指標造成干擾，可靠性欠佳。有學者用0.9%氯化鈉溶液注入兔腰椎椎間盤，以避免化學物質干擾，也成功建立了模型［16］。

2.2 終板損傷

終板是椎間盤營養代謝的通道，同時也是隔絕自身免疫系統攻擊的屏障，終板受損會導致椎間盤組織的營養供給阻斷，并暴露于免疫系統之下。引發終板損傷的方法主要包括終板穿刺、藥物注射和營養阻斷等。與切開纖維環、腰椎動靜力失穩模型相比，終板穿刺方法造成的退行性變更為平緩。對恒河猴L5/L6椎間盤上、下終板分別注入2 mg平陽霉素可成功建立模型［17］。Yin等［18］在羊腰椎距上、下終板2 mm處開一道2～3 mm細縫，并填充骨水泥阻斷終板營養，48周時觀察到髓核細胞成分進行性丟失，軟骨終板進行性鈣化，封閉的椎間盤內Ⅰ型膠原蛋白增加、Ⅱ型膠原蛋白減少，證明阻斷營養途徑可以誘導IDD。Fernández-Susavila等［19］采用終板下鉆孔后橫向擺動鉆頭的方式完全破壞終板血液供應，成功建立SD大鼠IDD模型。但Hutton等［20］對破壞終板結構建立的IDD模型的可信度提出質疑，并使用骨水泥將犬腰椎椎間盤上終板或同位椎間盤上、下終板進行封閉，在70周的觀察中并未發現任何明顯的IDD現象。

2.3 纖維環損傷

手術切開纖維環是最早的纖維環損傷模型建模方法，造成IDD效果顯著，但對纖維環破壞太大，易引起髓核脫出，很快便被纖維環穿刺法取代，其中經腹膜外穿刺最為常用。用18G針頭對L4/L5和L5/L6椎間盤進行穿刺，可成功建立兔腰椎IDD模型［21］。結合低溫等離子消融技術誘導的IDD過程較單純穿刺更為緩慢［22］。隨著技術的不斷進步，可在透視引導下經皮完成纖維環穿刺術，所建立的兔、犬腰椎IDD模型均有充分影像學及組織學證據，此方法減少了對實驗動物的損傷、降低了感染率，但對操作者技術要求更高［23-24］。與其他損傷模型相比，纖維環穿刺模型不僅造模周期短（2周即可出現IDD現象，腰椎失穩法則需4周［25］），且損傷程度小，效果確切，可控性好，成功率高，是目前最為常用的模型之一。但其機制本質是急性損傷造成IDD，客觀來說未能準確模擬人類IDD的發生機制，造成的IDD過于嚴重且不可逆，可能會影響對于藥物等防治手段治療腰椎IDD的機制研究。

3 生物力學模型

3.1 異常應力

異常應力模型是通過機械裝置向椎間盤施加負荷。鼠的尾椎定位便捷，這使其成為這類實驗首選動物。1952年，Lindblom［26］將鼠尾“U”形固定一段時間后觀測到鼠尾凹側發生IDD，后來學者們根據這一研究不斷優化彎曲應力模型［27］，并利用軸向負荷造模。1999年，Iatridis等［28］設計了Ilizarov-type加壓裝置，這是研究軸向壓縮應力對椎間盤影響的經典靜態模式。與針刺損傷法相比，靜態加壓法造成的IDD病理分級更高［29］。隨著軸向加壓裝置的精簡化，軸向應力模型實現了對加壓大小、頻次及動態加壓的精準控制［30-32］。但由于鼠尾椎結構細小，置入裝置不便，學者們將目光轉向體積更大的山羊腰椎，效果也十分理想［33］。軸向加壓裝置的反向應用則證實了過度的張力負荷也可誘導IDD［34］。由于人類獨特的直立運動方式，使人類脊柱呈現獨特的生理彎曲，這意味著人類的椎間盤承載更多的剪切應力。有研究［35］表明，剪切應力確實會對椎間盤造成損傷，應用剪切力加載裝置可成功構建剪切應力模型。

此類模型選材不受限制，可操作性好，造模周期短，效果穩定。但目前的異常應力模型多研究彎曲、軸向加壓、剪切等單一應力對椎間盤的影響，與人體椎間盤日常生理和病理應力情況相比，無論是受力方式還是作用部位，都有明顯的區別。同時，鼠尾椎椎間盤與人腰椎椎間盤解剖結構、體積大小相差甚遠，不適于進行相關生物治療研究。在置入裝置的過程中易出現局部感染、椎體骨折、脊髓損傷甚至死亡等情況［36］，這些均阻礙其成為理想的實驗模型。

3.2 直立

對于雙后肢直立大鼠模型，目前采用的是出生2 d～1個月的幼鼠，造模方法為截去大鼠前肢，強迫大鼠模擬人類直立行走。Cassidy等［37］設計的雙后肢直立大鼠模型，結扎出生僅18～36 h的Wistar大鼠的雙前肢，將飼料和水維持在剛剛可得到的位置，并隨大鼠的成長逐漸升高位置，迫使大鼠使用雙后肢站立。截去2月齡SD大鼠雙前肢并采用該特殊方法飼養，處死動物后取L5/L6椎間盤檢查，可見IDD明顯，纖維環排列紊亂，髓核皺縮，終板不連續，椎體邊緣可見明顯增生，椎間隙高度變?。?8］。

雙后肢直立模型的造模時間跨度較大（6～18個月）；實驗動物的存活率不等（11.2%～21.0%）；選用大鼠的月齡也有差別。有學者對這種模型建立方法提出質疑，Bailey等［39］在對雙后肢大鼠和正常大鼠（四足鼠）進行的24 h連續對比觀察中發現，雙足大鼠直立活動時間并未較正常大鼠增加，并沒有建立真正意義上的“直立”模型。同時，這種模型建立方法在倫理上也存在爭議。實驗動物的選材也存在一定局限性，因較大型動物維持雙后肢站立行走難度較大，目前僅使用大鼠來建立直立模型。

強迫直立模型多選用兔進行造模，將新西蘭大白兔固定于直立管道中4～12周，可成功誘導IDD發生。造模過程中，椎間盤內纖維環層狀結構逐漸紊亂，髓核中蛋白多糖減少，造成椎間盤高度降低，且組織學改變先于影像學改變［40］。強迫兔直立的同時，在兔頸部額外增加600 g負重可加快IDD發生，14周可成功建立腰椎IDD模型。但作者同時指出，雖然負重項圈進一步增加腰椎軸向應力，加速IDD進程，但實驗動物的頸部項圈負重不宜超過其體質量的1/4，每日加載時間不宜超過6 h，否則動物可能發生易怒、食欲減退、腹瀉等不良反應［41］。

直立模型歷史悠久，操作簡單，其最大的優勢在于改變了實驗動物脊柱的生物力學分布，使其具有與人類腰椎IDD相似的應力環境，借助增加的異常應力來加速IDD的發生。

3.3 腰椎失穩

人類脊柱主要依靠椎體、關節突關節、附著于其上的肌肉及韌帶等組織維持穩定，脊柱在勞損、外傷和醫源性損傷時失去穩定，即可發生IDD。學者們依據這一理論建立失穩模型，包括了靜力失穩、動力失穩和動靜力失穩模型，模擬人類腰椎IDD的病理改變。靜力失穩模型一般是通過切除腰椎棘上韌帶、棘間韌帶和關節突關節的方式，破壞脊柱靜力平衡來建模；放射學和組織學檢查結果顯示靜力失穩模型與人類IDD相似［42］。動力失穩是通過多節段剝離骶棘肌和關節突附著肌肉或切斷豎脊肌直接破壞椎旁肌動力平衡。動靜力失穩模型是將以上2種結構全部切除或切斷來實現。在建立動靜力失穩家兔模型的基礎上，聯合額外負重法（在家兔背部壓重達體質量1/10的物體），可以加速建模過程［43］。腰椎失穩模型可用于模擬姿勢、環境因素導致的IDD。

3.4 腰椎融合

腰椎融合模型是通過椎體融合或椎間關節融合的方式，誘發相鄰椎間盤發生退行性變，達到模擬脊柱融合術后IDD的目的。此類造模方式需要一定體積的椎體，多選兔作為實驗動物。Higashino等［44］對兔L3～5橫突關節進行固定，影像學檢查結果表明，術后1年椎間盤發生明顯退行性變，而且固定椎體相鄰的頭側IDD更加嚴重。腰椎融合模型主要用于脊柱融合術后鄰椎病發生機制的研究。

4 其他模型

石芳芳等［45］通過結扎兔L4，5左側節段血管，造成L4/L5椎間盤雙側缺血，L3/L4椎間盤單側缺血，成功建立兔腰椎IDD模型，影像學表明IDD程度與缺血程度成正比。楊屆等［46］的實驗表明，大鼠雙側卵巢摘除術后8周，椎間盤開始出現明顯退行性變，12周時退行性變更加嚴重。

5 結語與展望

動物模型能否適用于腰椎IDD發生機制或相關治療研究，主要視動物模型與人類腰椎IDD相關性和相似度大小而定。IDD模型的制備已有近80年的歷史，應用的實驗動物包括大鼠、小鼠、沙鼠、兔、犬、豬、羊和靈長類動物等。因實驗動物脊柱與人類在生長發育、解剖結構、生物力學和生物化學等方面的差異，及隨著年齡增長IDD發生率的變化不同，至今尚無公認的理想動物模型。靈長類動物與人類親緣關系最近，是最理想的模型動物，但來源稀少、飼養困難，并涉及倫理等問題，不適宜廣泛應用；綿羊脊柱及椎間盤的解剖結構與人類差異較大，力學性能也有所不同［47］；犬類IDD的髓核脊索細胞被軟骨細胞樣細胞替代，這點與人類相似，但犬的腰椎椎間盤數量比人類多2個，且軟骨終板比人類厚［48］；大、小鼠和家兔等小型四足動物椎間盤的內部壓力可能與人類相近，且考慮到實驗成本等，大、小鼠和家兔仍然是大多數學者的選擇［49］。

學者們通過模擬人類直立、勞損、損傷、醫源性損傷等導致IDD的常見因素，成功建立動物腰椎IDD模型。但動物種屬及椎間盤解剖形態、生化特性等與人類椎間盤不同，目前的IDD模型只能盡量模擬人類IDD，仍需彌補各自不足。自發模型較為符合IDD發生過程，但重復性較差，退行性變程度不可控。椎間盤損傷模型可控性好，效果確切，但與客觀IDD發生過程的符合程度有限。不同于四足動物，人類脊柱的長期直立狀態和腰椎生理曲度的存在，使L4/L5和L5/S1椎間盤處于剪切應力之下，成為IDD發生的主要原因。因此，模擬人類腰椎IDD真實力學環境的直立模型是研究腰椎IDD的可靠模型。但如何快速、有效構建生物力學模型仍需進一步研究。目前對IDD機制的闡釋還不是非常理想，如何模擬人體脊柱復雜的生理狀態和病理改變，構建出更加符合人類腰椎IDD過程的動物模型仍是今后工作的重點。