非結(jié)核分枝桿菌病分子診斷技術(shù)概述

廖鑫磊 王桂榮

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)指除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)和麻風分枝桿菌以外的分枝桿菌。截止2021年1月，分枝桿菌屬已有240個種，24個亞種(http://www.bacterio.net/mycobacterium.html)。NTM廣泛存在于水、土壤、灰塵等自然環(huán)境中，屬于條件致病菌[1]。NTM病是指人體感染了NTM，并引起相關(guān)組織、臟器的病變[2]。近年來，全球NTM病呈快速增多趨勢，已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題[3]。NTM病與結(jié)核病在臨床表現(xiàn)和影像學表現(xiàn)上都非常相似， NTM病主要依靠實驗室病原學檢測進行診斷。隨著NTM病的增多，人們對其危害性越來越重視，早期診斷及早期治療可降低NTM對人體的損害。為提高NTM病的診斷水平，除了需增強醫(yī)務(wù)工作者對NTM病的認識，提高對NTM的檢測、鑒定以及耐藥診斷能力，還需增加對NTM實驗室檢測方法的認識，提高NTM病的病原學陽性率。對硝基苯甲酸選擇性培養(yǎng)基法和MPB64抗原檢測法僅可初步鑒別MTBC與NTM；質(zhì)譜技術(shù)可鑒別至菌種水平，但不可直接用于臨床標本，只可用于培養(yǎng)陽性菌株，不利于臨床及時診斷。隨著分子生物學的發(fā)展，分子診斷技術(shù)在分枝桿菌菌種鑒定中發(fā)揮著越來越重要的作用，筆者對用于NTM檢測及鑒定的分子技術(shù)進行概述。

一、NTM檢測技術(shù)

因NTM與結(jié)核分枝桿菌的藥物敏感性不同，治療方案存在較大差異，因此治療前需準確地檢測鑒別患者是結(jié)核病還是NTM病?，F(xiàn)有一些分子技術(shù)可從標本中直接檢測NTM或同時鑒別MTBC與NTM。Scoleri等[4]研發(fā)了一種以hsp65為靶基因的TaqMan定量PCR技術(shù)，可以直接從呼吸道樣本中檢測NTM。韓國3種可鑒別MTBC與NTM的試劑盒：(1)AdvanSureTMTB/NTM實時熒光PCR試劑盒，以MTBC和NTM的IS6110和轉(zhuǎn)錄間區(qū)序列(internal transcribed spacer，ITS)為靶基因；(2)GENEDIA?MTB/NTM實時熒光PCR試劑盒，以MTBC的IS6110以及NTM的ITS和rpoB為靶基因；(3)Real-Q MTB & NTM試劑盒，以MTBC和NTM的IS6110和ITS為靶基因[5]。檢測標準菌株時，AdvanSure、Genedia、Real-Q的準確度分別為100.0%、98.8%和98.8%，檢測臨床菌株時3種試劑盒的敏感度均大于95%[5]。AdvanSure檢測呼吸道樣本時的敏感度和特異度分別為97.9%和100.0%，而非呼吸道樣本占總樣本30.5%時AdvanSure的敏感度和特異度分別降為91%和87%[6-7]。這是由于非呼吸道樣本中含有PCR抑制物可降低實時熒光PCR技術(shù)的敏感度。NTM檢測的特異度受與NTM相近的其他非分枝桿菌屬細菌的影響，比如Rhodococcus，Tsukamurella，Segniliparus和Gordonia屬的一些成員與分枝桿菌屬在系統(tǒng)發(fā)育上非常相近，都屬于Corynebacterineae亞綱，若樣本中存在這些細菌可能會出現(xiàn)假陽性結(jié)果[5]。由于NTM廣泛存在于環(huán)境中，特別是水中，因此樣本采集時還要注意避免污染[8]。

二、NTM菌種鑒定分子技術(shù)

1. 直接探針雜交法:直接探針雜交法不需要擴增步驟，因此可以實現(xiàn)快速診斷。AccuProbe鑒定系統(tǒng)(AccuProbe；Hologic公司，美國)依靠與16SrRNA互補的寡核苷酸探針，可鑒別MTBC、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、戈登分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌[9]，AccuProbe的最大缺點是不能鑒定臨床上非常重要的膿腫分枝桿菌。

2. 線性探針技術(shù):線性探針技術(shù)(1ine probe assay，LPA)的原理是通過應(yīng)用生物素標記的特異引物進行靶核酸(DNA)的擴增，將擴增產(chǎn)物變性后與固定在尼龍膜上的特異寡核苷酸探針雜交，通過酶聯(lián)免疫顯色法顯示結(jié)果[10]。比較有代表性的LPA試劑盒有INNO-LiPA Mycobacteria v2(INNOLiPA；Fujirebio Europe，比利時)；GenoType Mycobacteria CM，GenoType Mycobacteria AS和GenoType NTM-DR (Hain生命科學，德國)；Speed-oligo Mycobacteria(Vircell，西班牙)；AdvanSure Mycobacteria GenoBlot Assay(LG Chem Inc.，韓國)和 REBA Myco-ID (YD診斷學，韓國)。INNO-LiPA Mycobacteria v2以16S-23SrRNA間區(qū)為靶基因，可鑒別16種分枝桿菌[11]；GenoType Mycobacteria CM和GenoType Mycobacteria AS均以23SrRNA為靶基因，分別可鑒別14種和16種分枝桿菌[12-13]；Speed-oligo Mycobacteria以16SrRNA和16S-23SrRNA間區(qū)為靶基因，可鑒別14種分枝桿菌[14]；AdvanSure Mycobacteria GenoBlot assay以16S-23SrRNA間區(qū)為靶基因，可鑒別21種分枝桿菌[10]；REBA Myco-ID以rpoB為靶基因，可鑒別17種分枝桿菌，并可將馬賽分枝桿菌與膿腫分枝桿菌區(qū)分開[15]。GenoType NTM-DR不僅可將臨床常見的NTM鑒定至種水平，包括膿腫分枝桿菌復(fù)合群(膿腫分枝桿菌、馬賽分枝桿菌和bolletii分枝桿菌)、龜分枝桿菌和鳥胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合群(鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和奇美拉分枝桿菌)，同時還可以通過檢測erm(41) 和rrl基因的突變情況確定NTM對大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥性，以及通過檢測rrs基因的突變情況確定NTM對氨基糖苷類藥物的耐藥性[16-17]。

3.基因芯片法:基因芯片又稱DNA微陣列，基本原理是通過微陣列技術(shù)將多種DNA探針有序地、高密度地排列在玻璃片或纖維膜等載體上，然后與標記的樣品雜交，通過檢測每個探針分子的雜交信號強度，進而獲取樣品分子的數(shù)量和序列信息?；蛐酒夹g(shù)具有快速、準確、高通量、自動化程度高等優(yōu)點。國內(nèi)已有用于分枝桿菌菌種鑒定的基因芯片產(chǎn)品上市，如晶芯?分枝桿菌菌種鑒定芯片試劑盒(北京博奧生物有限公司)。該試劑盒以16SrRNA為靶基因，可鑒別17種分枝桿菌。檢測結(jié)核分枝桿菌的敏感度和特異度分別為99.8%和99.7%，檢測NTM的敏感度和特異度分別為98.8%和100.0%[18-19]。

4. 反向斑點雜交法:反向斑點雜交技術(shù)(reverse blot hybridization assay，REBA)工作原理為先將已編號的寡核苷酸探針點到硝酸纖維素膜或尼龍膜上，然后與生物素等標記的PCR擴增產(chǎn)物進行雜交，通過膜條特定位置顯色與否判斷探針是否與該DNA片段雜交。具有敏感度高、特異度強、穩(wěn)定性好的特點。國內(nèi)試劑盒有分枝桿菌菌種鑒定基因檢測試劑盒[亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司]，以16S rRNA為靶基因，可鑒定臨床上22種常見的致病性分枝桿菌，檢測NTM的敏感度和特異度分別為87.61%和83.33%[20-21]。

5. 特異基因測序法:與傳統(tǒng)方法相比，特異基因測序法進行菌種鑒定既快速又準確。特異基因測序法目前已經(jīng)成為菌種鑒定的“金標準”。許多基因已用于分枝桿菌菌種鑒定，如16SrRNA、hsp65、rpoB、ITS、gyrB、danA、recA和secA等[22]。

獲得DNA序列后，進行序列比對分析時需要使用數(shù)據(jù)庫[22]。有一些公用數(shù)據(jù)庫及比對工具可用，如NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/identify)、Ribosomal Database Project(RDP，http://rdp.cme.msu.edu)和leBIBI(https://umr5558-bibiserv.univlyon1.fr/lebibi/lebibi.cgi)[23]。

16SrRNA是細菌分類和鑒定中最常用的基因，全長1550 bp左右，是30S小核糖體亞單位的重要組成部分[22]。可以使用16SrRNA全長序列，也可以使用長度為440 bp左右的5′端堿基序列差異相對集中的區(qū)域進行菌種鑒定。16SrRNA全長序列的鑒別能力優(yōu)于5′端高可變區(qū)序列，但是應(yīng)用5′端高可變區(qū)序列作為目標基因僅需要一個測序反應(yīng)即可完成，且其鑒別能力與全長序列比較接近，因此5′端高可變區(qū)序列應(yīng)用更為廣泛。由于序列高度保守性，16SrRNA對一些具有臨床意義的NTM分辨力較差，僅能鑒定至復(fù)合群水平而不能鑒定到具體菌種，如鳥分枝桿菌復(fù)合群、膿腫分枝桿菌復(fù)合群、偶發(fā)分枝桿菌復(fù)合群等[24]。hsp65比16SrRNA基因變異性大，因此鑒定能力高于16SrRNA序列，可區(qū)分16SrRNA序列無法區(qū)分的部分種類分枝桿菌，特別是快生長NTM[25]。此外，rpoB和ITS基因也常用于NTM菌種鑒定而且分辨能力較高[25-27]。特異基因測序多為實驗室自建的方法，也有商業(yè)試劑盒。MicroSEQ ID系統(tǒng)(ThermoFisher Scientific，美國)可對16SrRNA的5′端500 bp和全長1500 bp進行快速簡便的擴增和測序[28]。序列可與MicroSEQ ID圖書館的數(shù)據(jù)進行比對獲得菌種匹配結(jié)果。

有些菌種存在一定的種內(nèi)變異，如鳥分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌和戈登分枝桿菌[11,22]。還有一些NTM菌種具有完全一致的單基因序列，單基因測序并不能將這些NTM區(qū)別開，因此，需進行多基因聯(lián)合比對才能鑒定至種水平[29]。

公共數(shù)據(jù)中DNA序列多樣化，但對于上傳的序列缺乏監(jiān)管，可能存在一些不準確或錯誤的基因序列信息。當使用公共數(shù)據(jù)庫時應(yīng)仔細選取參考序列進行比對[22]。雖然也有一些商業(yè)化數(shù)據(jù)庫可用，如MicroSEQ或RipSeq Single/Mixed系統(tǒng)(Pathogenomix，美國)，Integrated Database Network System (IDNS；SmartGene Inc.，瑞士)和GenSeizer(GenSeizer，上海，中國)[30-32]。這些數(shù)據(jù)庫都還在持續(xù)更新中。

6. 全基因組測序法:在菌種鑒定和分型方面，全基因組測序法可提供最深入的信息[33]。全基因組測序具有較高的敏感度及強大的鑒別能力，在無法獲得可能感染病原體線索的情況下，臨床應(yīng)用越來越多。目前全基因組測序的價格依然較高且全基因組測序應(yīng)用的是數(shù)據(jù)處理過程。測序會產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)，需要高效的計算機分析系統(tǒng)、較高的數(shù)據(jù)存儲能力、高速的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)[34]，尚不適合大規(guī)模應(yīng)用。全基因組測序還主要是用于流行病學研究，而非菌種鑒定。全基因組測序技術(shù)要更好的應(yīng)用于臨床上菌種鑒定，其操作步驟、生物信息學分析以及質(zhì)量控制方面都需要進一步標準化[35]，需要結(jié)合臨床醫(yī)學與微生物學知識做出正確的結(jié)果判讀。

隨著技術(shù)進步，分子診斷技術(shù)在NTM檢測、菌種鑒定方面有著獨特的優(yōu)勢和巨大的應(yīng)用前景，但應(yīng)用于臨床實踐中，還需要結(jié)合實際情況選擇合適的技術(shù)，以及提升NTM檢測和菌種鑒定技術(shù)能力。