自然殺傷細胞在頭頸部鱗癌發展及治療中的研究進展

王鹿鳴，謝 尚

1. 北京大學口腔醫學院（北京 100081）

2. 北京大學口腔醫院口腔頜面外科（北京 100081）

3. 國家口腔疾病臨床醫學研究中心（北京 100081）

4. 口腔數字化醫療技術和材料國家工程實驗室（北京 100081）

5. 口腔數字醫學北京市重點實驗室（北京 100081）

頭頸部鱗癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，其轉移率較高，生存率較低，常伴有發音、進食等功能的障礙和面部外形的破壞[1]。研究發現頭頸部鱗癌表現出免疫抑制的特點[2]。自然殺傷（nature killer，NK）細胞作為腫瘤免疫的第一道防線，在早期清除腫瘤細胞及激活下游免疫細胞上有重要作用，其功能的抑制往往導致腫瘤的免疫逃逸。本文就NK細胞的生物學特性、抗腫瘤機制、在頭頸部鱗癌中的活化水平、基于NK細胞的免疫逃逸及目前與NK細胞相關免疫療法的研究進展進行綜述。

1 NK細胞的生物學特性及抗腫瘤機制

NK細胞是先天免疫系統的重要效應細胞，約占所有外周淋巴細胞的10%～15%。靜止的NK細胞多存在于外周血中，肝臟、脾臟及腹膜腔內也有NK細胞存在。被細胞因子激活后，NK細胞能夠遷移并滲入大多數含有病原體感染或惡性細胞的組織中[3-4]。

NK細胞可根據表面標記物的差異性表達劃分為具有不同功能特性的亞群。一般來說，NK細胞被定義為CD3-CD56+細胞，并可通過抗原CD56的豐度分為CD56dim和CD56bright兩個亞群。其中，CD56dim的NK細胞約占總數的90%，多存在于外周血循環中；而約占總數10%的CD56brightNK細胞則主要位于次級淋巴組織中[5-7]。CD16是另一種常用的NK細胞表面標記物，其表達規律與CD56的豐度有關：CD56dimNK細胞常表達高水平的CD16（CD16high），而CD56brightNK細胞伴隨CD16的表達缺失或低水平表達（CD16-/low）。從功能上講，CD16使NK細胞能夠檢測抗體包被的靶細胞并發揮抗體依賴性細胞毒性（antibody-dependent cellular cytotoxicity，ADCC）[8]。此外，CD56brightNK細胞表面穩定表達抑制性主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC） I類結合受體 CD94/NKG2A，但缺乏殺傷細胞免疫球蛋白樣受體（killer cell immunoglobulin-like receptors，KIRs） 和 激 活性MHC I類結合受體CD94/NKG2C的表達。而CD56dimNK細胞則顯示出CD94/NKG2A、CD94/NKG2C和KIRs的多樣化表達[9]。這種不同亞群間表面標記物的差異性表達與他們不同的功能直接相關：CD56dimCD16highNK細胞識別靶細胞并分泌高水平的穿孔素和顆粒酶，有較強的細胞毒性，可發揮免疫監控的作用[10-11]；CD56brightCD16-/lowNK細胞則具有較弱的細胞毒性和介導ADCC的功能，更多地通過響應單核細胞分泌的炎癥因子產生大量的細胞因子和趨化因子，如干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子β（tumor necrosis factor-β，TNF-β）及白細胞介素10（interleukin-10，IL-10）等，發揮免疫調節的作用[12-13]。

NK細胞的主要功能為裂解靶細胞和提供免疫調節。NK細胞與T細胞同為直接殺傷細胞，但應答過程無需識別抗原預先致敏，具有應答快速的特點。NK細胞的活性受表面抑制性受體如CD94/NKG2A、KIRs、T 細胞免疫球蛋白和粘蛋白結構域3（T cell immunoglobulin and mucin domain-3，TIM-3），以及活化性受體如CD16（FcγRIIIa）、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46等的共同調節。生理狀態下，正常細胞表面的配體結合NK細胞的抑制性受體，抑制性受體信號轉導，NK細胞處于靜息狀態，避免殺傷正常細胞；病理狀態下，腫瘤細胞表面的抑制性配體減少或活化性配體增加，NK細胞活化，通過胞吐穿孔素和顆粒酶、人凋亡相關因子配體（factor associated suicide ligand，FasL）和TNF相關的細胞凋亡誘導配體（TNF-related apoptosisinducing ligand，TRAIL）的激活，或通過ADCC誘導靶細胞的凋亡[5]。NK細胞還可以通過分泌細胞因子和趨化因子，激活下游適應性免疫反應，發揮免疫調節的作用[8]。

2 NK細胞在頭頸部鱗癌中的表達、活化水平及與預后的關系

NK細胞參與了腫瘤防御的第一道防線，而頭頸部鱗癌中常出現NK細胞數量減少、低水平浸潤或功能喪失。研究顯示，頭頸部鱗癌患者的癌組織中僅能檢測到低水平的NK細胞浸潤，且多為調節性的CD56brightNK細胞而不是具有細胞毒性的CD56dimNK細胞[14-15]。此外，腫瘤浸潤性NK細胞活性升高的患者預后更加良好，且區域淋巴結轉移和遠處轉移的發生率也更低[16-17]。相對的，低NK細胞毒性的患者區域和遠處轉移的發生率更高，且死亡風險更高。分析發現這類患者的外周血中存在一種免疫復合物，可抑制NK細胞的功能[18]。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）陽性患者的CD56dimNK細胞腫瘤浸潤比率要高于HPV陰性患者，這可能是HPV陽性患者臨床預后較好的原因[19]。與CD56類似，表面抗原CD57與良好預后、低淋巴結轉移率成正相關[20-21]。對外周血循環中的NK細胞進行檢測發現，早期腫瘤患者外周血循環中的NK細胞數量高于晚期腫瘤患者[22]。同腫瘤組織浸潤的NK細胞類似，循環NK細胞的數量[23-24]及細胞毒性水平降低[25]，CD56brightNK細胞的數量多于CD56dimNK細胞；進一步研究發現CD56dimNK細胞較CD56brightNK細胞優先發生自發凋亡[26]。雖然也有研究報道循環NK細胞中CD56dimNK細胞的比例上升，但仍檢測到了總體循環NK細胞數量的減少和細胞毒性的抑制[27]。提示隨著腫瘤發展進程，NK細胞的數量和功能可能受到抑制。

放療聯合化療是局部晚期和轉移的頭頸部鱗癌的治療方案。放化療的全身性副作用包括對免疫功能的抑制。一項對23例僅接受放療的患者的調查發現，放療前后循環NK細胞的水平無明顯變化[28]，另一研究發現化療（順鉑/紫杉醇與卡鉑/多西他賽聯合方案）后NK細胞數量減少，而同期放化療后NK細胞數量增多[29]。由于目前對NK細胞的活化水平不明確，故NK細胞對放化療療效的影響仍待進一步研究。

NK細胞的部分配體也可作為頭頸部鱗癌預后及預測臨床病理特征的指標。抑制性受體癌胚抗原相關細胞黏附分子1（carcinoembryonic antigen cell adhesion molecule 1， CEACAM1）的高表達與生存率降低和預后不良有關[30-31]，CEACAM1還抑制活化受體NKG2D的信號傳導，并因此抑制NK細胞的抗腫瘤功能[32]。而CEACAM1的配體RCAS1可誘導NK細胞凋亡，進而在腫瘤細胞的免疫逃逸中起作用。研究顯示其在腫瘤細胞中的高表達預示著較高的腫瘤分級及淋巴結轉移[33]。

3 基于NK細胞的頭頸部鱗癌免疫逃逸

頭頸部鱗癌的免疫系統多處于抑制或失活狀態[34]。NK細胞通過細胞毒性和免疫調節發揮對腫瘤細胞的監管作用，而腫瘤細胞則通過一系列方式逃逸NK細胞的監管作用。頭頸部鱗癌細胞產生各種細胞因子，或使抑制性受體信號轉導增強，或使活化性受體信號阻斷，或通過腫瘤微環境（tumor microenvironment，TME）抑制NK細胞募集，最終導致NK細胞抗腫瘤功能的下降。

抑制NK細胞表面的活化性受體是頭頸部鱗癌細胞免疫逃逸的常見原因。程序性死亡1（programmed death 1，PD-1）在NK細胞上高表達時是一種NK細胞的激活表型，高水平的循環PD-1陽性NK細胞與更好的總體生存率相關。PD-1陽性NK細胞富集于腫瘤組織中，但其對NK細胞的活化作用在與TME中的程序性死亡配體1（programmed death ligand 1，PD-L1）結合后喪失[22]。大多數頭頸部鱗癌過表達表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR），而PD-L1的表達受EGFR及其下游JAK2/STAT1依賴性誘導，最終過表達PD-L1的頭頸部鱗癌逃避NK細胞的監視[35]。NKG2D是NK細胞表面的活化性受體，在免疫監視中起著重要的作用，因此頭頸部鱗癌細胞通過分泌各種NKG2D配體（NKG2DLs）來逃避NK細胞的監視。高水平NKG2DLs存在下NK細胞不能浸潤腫瘤組織且細胞毒性降低，而從頭頸部鱗癌患者血漿中去除脫落的NKG2DLs可以恢復NK細胞功能[14]。復發的頭頸部鱗癌中可溶性主要組織相容性復合物I類鏈相關肽A和轉化生長因子-β的表達升高，并抑制依賴NKG2D的NK細胞活化[36]。同為活化性受體的NKp30和NKp46也有表達下降的報道[37]。

NK細胞抑制性受體及其配體的過度表達也是頭頸部鱗癌細胞免疫逃逸的原因。CD56dimNK細胞受其表面抑制受體KIRs的控制。研究顯示頭頸部鱗癌較其他實體瘤表達更高水平的KIRs[2]，意味著NK細胞的活性可能因此受到抑制，頭頸部鱗癌患者更有可能在抗KIRs抗體治療中獲益。顧小軍等的研究發現口腔鱗癌患者外周血NK細胞表面抑制性受體TIM-3表達上升，并與腫瘤臨床分期、分化程度及淋巴結轉移顯著相關，提示其與口腔鱗癌的發生發展有關[38]。

Ludwig等的研究顯示，頭頸部鱗癌患者的血漿中分離出的外泌體可下調NKG2D表達水平并抑制NK細胞的細胞毒性作用[39]，而前述NKG2DLs通過外泌體釋放后較單體NKG2DLs引起更多的NKG2D下調[40]；Theodoraki等也報道了頭頸部鱗癌患者血漿中可分離出攜帶PD-L1的外泌體，且外泌體內的PD-L1水平與腫瘤的活動性和淋巴結狀態相關[41]，提示腫瘤免疫逃逸的新機制及外泌體作為癌癥進展的非侵入性標志物和免疫功能低下指標的潛力。

除上述調節方式外，NK細胞與頭頸部鱗癌腫瘤患者的其他免疫效應細胞如樹突狀細胞（dendritic cell，DC）、調節性T細胞及調節性B細胞等之間還存在復雜的調節網絡，有待進一步的研究[42-46]。

4 基于NK細胞的免疫療法在頭頸部鱗癌治療方案中的應用

目前，基于NK細胞的免疫療法側重于恢復或增強NK細胞的細胞毒性作用。主要方法包括以下幾類：①基于西妥昔單抗（Cetuximab ）的聯合用藥方案；②基于白細胞介素家族細胞因子的聯合用藥方案；③經工程改造的NK細胞產物療法等。

Cetuximab已被列入過表達EGFR的頭頸部鱗癌（約占總數90%）的治療方案。Cetuximab包被EGFR陽性HNSCC細胞后，通過與NK細胞表面的活化性受體FcγRIIIa結合激活NK細胞，進而NKG2D依賴性激發DC成熟、效應因子IFN-γ及趨化因子Th1分泌[47]。然而Cetuximab的臨床應答率僅為10% ～ 15%。Baysal等報道，Cetuximab耐藥性可能被基于NK細胞的免疫反應克服[48]。Faden等的研究發現，Cetuximab無應答的患者存在較高的人白細胞抗原-C（human leukocyte antigen-C，HLA-C）失活性突變，而HLA-C與NK細胞表面的KIRs結合后能夠激活NK細胞，針對HLA-C/KIRs軸的聯合用藥方案（如抗KIRs單克隆抗體Lirilumab與Cetuximab）可以取得更好的臨床治療效果[49]。Jie等報道Cetuximab上調CTLA-4+調節性T細胞（regulatory T cells，Treg），使ADCC受到抑制；使用Ipilimumab消除腫瘤內的CTLA-4+Treg，增強Cetuximab誘導的NK細胞ADCC[50]。體外實驗中一種Toll樣受體8的激動劑也可以通過激活NK細胞及下游ADCC作用增強Cetuximab對頭頸部鱗癌細胞的殺傷作用[51]。Concha-Benavente等發現Cetuximab增加NK細胞上活化受體PD-1的表達，但被外源性PD-L1封閉；使用阻斷PD-1-PD-L1軸的Nivolumab可顯著增強Cetuximab對過表達PD-L1的頭頸部鱗癌細胞的毒性[22]。Bochen等的研究顯示，維生素D缺乏常見于頭頸部鱗癌患者，進行維生素D的替代治療后，腫瘤組織內及周邊的NK細胞浸潤增多，單獨用藥或與Cetuximab聯用均可增強NK細胞毒性[52]；STING激動劑與Cetuximab聯用也在體外實驗中展示了較單藥更好的抗腫瘤作用[53]。

白細胞介素家族中的數個因子被報道能夠促進NK細胞的活化。Pinette等的研究表明，IL-15具有促進NK細胞增殖、分化、存活和活化的功能，提高NK細胞分泌IFN-γ和T細胞趨化因子RANTES和IL-8的水平。體內實驗證實IL-15激動劑ALT-803和Cetuximab聯合用藥，可明顯減少裸鼠腫瘤體積[54]；I期臨床試驗中也觀察到了ALT-803對NK細胞數量和活性的良好的上調作用[55]。與IL-15有類似結構和作用的IL-12也在治療不可切除的原發或復發頭頸部鱗癌患者的I/II期臨床試驗中表現出了和Cetuximab的聯合治療作用[56]，一種攜帶IL-12的疫苗在裸鼠頭頸部鱗癌移植瘤模型中完全阻止了腫瘤復發[57]。同為IL-12家族的IL-27也可激活NK細胞，并通過誘導ADCC來抑制NK細胞抗性頭頸部鱗癌[58]。IL-2是已經證實的NK細胞活化性配體，在一項36例無法切除的頭頸部鱗狀細胞癌病例的IIb期臨床試驗中觀察到IL-2的經皮和結節內注射能夠提升NK細胞的腫瘤浸潤率和細胞毒性[59]。主要活性成分是IL-2，IL-1β，IFNγ和TNFα的細胞因子生物制劑IRX-2通過恢復活化性受體NKp30和NKp46的表達水平來恢復NK細胞功能，IIa期臨床試驗中觀察到了良好的耐受性和對總生存率的延長[37]。

PD-L1 t-haNK細胞是一種經過工程改造的高親和力NK細胞（high affinity NK cells，haNK細胞），表達CD16高親和力FcγRIIIa（158V）受體，可以內源性合成IL-2[60]及靶向PD-L1的特異性嵌合抗原受體，檢測發現該細胞可分泌更高水平的穿孔素和顆粒酶。PD-L1 t-haNK細胞的這些特征使其可以通過三種不同的機制靶向腫瘤細胞：嵌合抗原受體介導的殺傷、ADCC介導的殺傷和天然NK細胞受體介導的殺傷。體外實驗中，PD-L1 t-haNK細胞對來自乳腺、肺、結腸、泌尿生殖系統等20種組織的惡性腫瘤細胞都有較haNK細胞更良好的裂解作用，在與抗PD-1抗體和IL-15激動劑ALT-803聯用后對裸鼠頭頸部鱗癌移植瘤的生長有明顯的抑制作用[61-62]；將晚期HPV陰性頭頸部鱗癌患者的外周血白細胞與PDL1 t-haNK一起體外孵育24小時，顯著降低高表達PD-L1的巨噬細胞和CD14+/ CD15+骨髓細胞亞群[63]。這些結果提示了PD-L1 t-haNK細胞在治療高表達PD-L1的頭頸部鱗癌患者中的應用前景。

其他用藥方案還包括：對NK細胞表面受體抑制劑的開發如NKG2A的單克隆抗體Monalizumab[64]或NKp44的抑制劑[65]；基于細胞周期檢查點的開發如WEE1激酶抑制劑逆轉G2/M期細胞周期檢查點的激活，最終增加頭頸部鱗癌細胞對NK細胞裂解作用的敏感性[66]；使用CXCR1 / 2小分子抑制劑SX-682抑制骨髓來源的抑制性細胞的轉運，進而增強NK細胞的腫瘤浸潤和細胞毒性[67]；使用同樣具有激活NK細胞功能的Nimotuzumab替代Cetuximab，避免對TIM-3和PD-L1上調及Tregs細胞百分比上升造成的免疫逃逸[68-69]等。

5 結語

總體來看，NK細胞在頭頸部鱗癌中的功能受到抑制，使免疫系統無法及時清除腫瘤細胞，可能是導致頭頸部鱗癌發展及轉移的機制。考慮到頜面部組織保留的重要性，減少腫瘤體積以及由轉移或復發導致的多次手術具有重要意義。相比較其他手段，免疫療法通過重新激活NK細胞的抗腫瘤能力，靶向清除頭頸部鱗癌細胞，能夠更好地保留頜面部的形態和功能。然而NK細胞受抑制的機制復雜，既包括腫瘤細胞本身分泌的各種細胞因子在腫瘤微環境及外周血循環中對NK細胞的抑制，也涉及免疫系統各組分間復雜的調節網絡。目前的基于NK細胞的免疫治療方案，雖在體外及體內實驗上展現了良好的抗腫瘤能力，但由于NK細胞復雜的調控機制，與實際的臨床應用還有較大距離，NK細胞在頭頸部鱗癌治療中的應用有待進一步的探索。