替莫唑胺治療腦膠質(zhì)瘤患者HOXB9基因、多重耐藥相關(guān)分子的表達(dá)與相關(guān)性

張淑芳

（福建省南平市第一醫(yī)院放療科，福建 南平 353000）

膠質(zhì)瘤生長(zhǎng)迅速，具有較強(qiáng)的侵襲性，手術(shù)治療組織難度系數(shù)大，徹底清除病灶，許多藥物難以進(jìn)入血腦屏障，化療藥物長(zhǎng)期使用后會(huì)出現(xiàn)耐藥性，因此，即使是手術(shù)結(jié)合放療和化療的患者，也同時(shí)需要有效的治療基礎(chǔ)來(lái)提高化療的整體治療效果[1-2]。治療腦膠質(zhì)瘤的有效藥物包括替莫唑胺，但患者可能因耐藥性原因造成治療效果低下。以往的研究表明，替莫唑胺的耐藥與多藥耐藥蛋白有著緊密的聯(lián)系。多藥耐藥主要表現(xiàn)為多藥耐藥相關(guān)分子的異常表達(dá)，如P-GP、MGMT、DNA錯(cuò)配修復(fù)（MMR）系統(tǒng)等[3-4]。hMLH和hMSH2基因是否穩(wěn)定直接影響細(xì)胞的修復(fù)功能，而HOXB9在乳腺癌、肺癌等多種疾病中表達(dá)不同。在促進(jìn)腫瘤發(fā)展以及凋亡中起重要作用[5-6]。因此，研究HOXB9基因在腦膠質(zhì)瘤患者替莫唑胺化療中的表達(dá)是否具有合成代謝作用，以及HOXB9基因的表達(dá)與替莫唑胺化療耐藥之間是否存在一定的相關(guān)性，具有重要的臨床意義[7-8]。研究選取我院在2016年7月至2021年7月80例患者，觀察腦膠質(zhì)瘤化療患者HOXB9基因表達(dá)與多藥耐藥相關(guān)分子及上述指標(biāo)的關(guān)系?，F(xiàn)將具體內(nèi)容報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取我院在2016年7月至2021年7月所接收治療經(jīng)過(guò)化療的腦膠質(zhì)瘤患者共80例，按照患者是否對(duì)替莫唑胺產(chǎn)生耐藥性分別分為耐藥組及非耐藥組，兩組各40例。耐藥組中男21例，女19例，年齡在65～75歲，平均年齡（69.11±2.04）歲，非耐藥組中男20例，女20例，年齡在66～77歲，平均年齡（69.14±2.02）歲。兩組一般資料比較無(wú)明顯差異（P＞0.05）。且所有患者及家屬均知曉此次研究。此次研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理會(huì)支持。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均經(jīng)過(guò)磁共振成像確診為腦膠質(zhì)瘤。②所有患者術(shù)后均接受化療。③所有患者病理組織為完全封閉狀態(tài)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴隨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。②伴隨其他惡性腫瘤。③機(jī)體素質(zhì)低，不能忍受化療。④其他臟器功能障礙。

1.2 方法 所有儀器以及試劑：主要使用由中國(guó)科學(xué)院上海研究所生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所提供的人惡性膠質(zhì)瘤u251株；并且使用由Solarbio（美國(guó)）生產(chǎn)胎牛血清和DMEM，噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒選用碧鹽田生物科技有限公司，Tranawall試驗(yàn)箱由康寧（美國(guó)）制造，從AB-CAM（美國(guó)）中篩選出兔抗HOXB9和抗人IgG二級(jí)抗體，PrimeScript由上海吉馬制藥技術(shù)有限公司負(fù)責(zé)完成。CDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒由北京康美有限公司提供，用于熒光定量PCR。ENVISIONTM兔和大鼠染色試劑盒、SYBR Premix ExtaqTM II試劑盒和抗MGMT、HMSH2與HMLH多克隆抗體分別選自上?；蚬?、北京康威之生物技術(shù)有限公司、武漢寶西。樣品處理方法：所有樣品固定、脫水、切片、包埋、染色。以上操作嚴(yán)格按照試劑、儀器、試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，全過(guò)程由專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行，嚴(yán)格質(zhì)量控制。

1.3 觀察指標(biāo) ①觀察兩組患者的HOXB9基因、P-gP、MGMT、hMLH以及hMSH2的陽(yáng)性率以及陰性率。其中HOXB9基因判定方法為：選擇5個(gè)視野高功率場(chǎng)（細(xì)胞數(shù)＞200）觀察陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞的占比。檢測(cè)規(guī)則為：陽(yáng)性染色信號(hào)為核內(nèi)黃棕色顆粒，0為未染色，1為淺黃色，2為黃色，3為棕黃色；然后根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例評(píng)分為0分（陽(yáng)性細(xì)胞比例＜5%）、1分（≥5%和＜25%）、2分（≥25%和＜50%）、3分（≥50%和＜75%）和4分（≥75%）。相乘得最后分?jǐn)?shù)，并根據(jù)最終分?jǐn)?shù)計(jì)算著色程度。p-gp和mgmt檢測(cè)方法分為陽(yáng)性（膠質(zhì)瘤細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)可見(jiàn)棕色顆粒10%～30%）、強(qiáng)陽(yáng)性（陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥30%）和陰性（陽(yáng)性細(xì)胞少于10%）。HMLH和HMSH2通過(guò)隨機(jī)抽取10個(gè)高倍視野區(qū)的400個(gè)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞的比例來(lái)測(cè)定的。陽(yáng)性：腫瘤細(xì)胞可見(jiàn)棕黃色顆粒，陽(yáng)性細(xì)胞比例≥25%；陰性：陽(yáng)性細(xì)胞少于25%。在上述檢測(cè)結(jié)果中，以陽(yáng)性切片為對(duì)照，5%胎牛血清替代原代抗體為陰性對(duì)照。本研究以陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性均為陽(yáng)性。②使用回歸分析HOXB9基因?qū)τ诮邮芴婺虬坊煹幕颊叩哪退幮浴?/p>

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS20.0軟件進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料行χ2檢驗(yàn)與Logistic回歸分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOXB9基因與多藥耐藥相關(guān)分子的表達(dá) 經(jīng)過(guò)對(duì)比兩患者的HOXB9基因與多藥耐藥相關(guān)分子的表達(dá)可知，耐藥組的HOXB9以及P-gP、MGMT的陽(yáng)性率明顯高于非耐藥組（P＜0.05），hMLH以及hMSH2的陰性率明顯高于非耐藥組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組患者的HOXB9基因與多藥耐藥相關(guān)分子的表達(dá)比較[n（%）]

2.2 HOXB9基因?qū)τ诮邮芴婺虬坊煹幕颊叩哪退幮曰貧w分析 經(jīng)過(guò)分析HOXB9基因?qū)τ诮邮芴婺虬坊煹幕颊叩哪退幮钥芍越邮芴婺虬坊煹幕颊叩哪退幮詾橐蜃兞?，以HOXB9基因?yàn)樽宰兞?，?jīng)Logistic回歸分析證實(shí)HOXB9可能是影響患者耐藥的影響因素（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 HOXB9基因?qū)τ诮邮芴婺虬坊熁颊叩哪退幮曰貧w分析

3 討論

膠質(zhì)瘤抗性機(jī)制是復(fù)雜的、多層次的。盡管對(duì)耐藥基因及其產(chǎn)物進(jìn)行了許多臨床研究，但在接受化療的患者中，耐藥基因與其耐藥性之間的聯(lián)系尚不清楚。研究腦膠質(zhì)瘤患者的耐藥性對(duì)于降低其耐藥性和提高臨床化療效果至關(guān)重要[9-13]。研究表明，腦膠質(zhì)瘤患者化療耐藥是多種因素綜合作用的結(jié)果。膠質(zhì)瘤患者化療耐藥的原因主要包括：①化療對(duì)跨越屏障沒(méi)有幫助。②少量膠質(zhì)瘤藥物積累。③加速許多化療藥物的解毒和代謝。④DNA損傷和修復(fù)的影響等。近年來(lái)，腦腫瘤化療的臨床研究進(jìn)一步發(fā)展，HOXB9基因及多藥耐藥相關(guān)分子P-gP、MGMT、HM-LH、hMSH2等的表達(dá)產(chǎn)物與腦膠質(zhì)瘤患者化療耐藥密切相關(guān)[14-17]。替莫唑胺含有大量咪唑嗪環(huán)，為首要化療藥物。它容易進(jìn)入血腦屏障，引起細(xì)胞DNA烷基化，進(jìn)而發(fā)揮毒性作用。其雖在一定程度上改善了患者預(yù)后，但療效較差，尤其對(duì)復(fù)發(fā)患者，主要原因是患者對(duì)替莫唑胺的耐藥增加。因此，探索一種有效逆轉(zhuǎn)耐藥的方法，對(duì)于提高該病患者的化療療效具有重要意義。

HOXB9基因?qū)儆贖OX家族。研究表明HOX家族成員在參與胚胎生長(zhǎng)、干細(xì)胞自我修復(fù)和再生以及組織重建等生理過(guò)程的同時(shí)，還與許多外來(lái)生物的生長(zhǎng)和進(jìn)化密切相關(guān)。此外，它們可以編碼轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)它們之間的共同基因表達(dá)[18-20]。龍璐璐等[21]研究人員研究發(fā)現(xiàn)HOXB9基因是一種抑癌基因，HOXB9基因在甲狀腺乳頭癌的增殖中發(fā)揮著重要作用，可以成為治療的新目標(biāo)。這些結(jié)果表明HOXB9基因可能為治療提供新的思路。

MGMT是DNA修復(fù)酶，可以幫助染色體避免化學(xué)物質(zhì)造成的損傷，這些物質(zhì)有助于治療藥物的細(xì)胞解毒。P-gP分布在細(xì)胞膜上具有分泌和分泌功能，其主要生理功能包括維持正常生理、激素和轉(zhuǎn)化以及調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。吞咽、呼吸代謝和藥物解毒[22-24]。依賴(lài)能源的藥物出口泵不僅在抗腫瘤藥物的匯合點(diǎn)，而且在抗腫瘤藥物的交配點(diǎn)。因此一旦P-gP和抗腫瘤藥物結(jié)合起來(lái)，就可以通過(guò)ATP裝置產(chǎn)生能量，ATP裝置將致癌灶細(xì)胞泵出，并減少細(xì)胞中濃度改變，降低藥物作用，產(chǎn)生一定的耐藥性。其中hMLH和hMSH2是主要基因，對(duì)控制基因改變和保持功能的完整性十分重要。錯(cuò)誤修復(fù)系統(tǒng)中的任何基因變化都可能導(dǎo)致細(xì)胞功能的喪失，使其錯(cuò)誤復(fù)制或不穩(wěn)定[25-27]。本研究結(jié)果提示HOXB9基因的表達(dá)可能與腦膠質(zhì)瘤患者對(duì)替莫唑胺化療產(chǎn)生耐藥性有關(guān)。HOXB9基因的高陽(yáng)性表達(dá)率可能是腦膠質(zhì)瘤患者對(duì)替莫唑胺化療耐藥的一個(gè)影響因素。且該結(jié)果與Bai等[28]研究結(jié)果中HOXB9基因陽(yáng)性率具有一致性。因此該病患者在應(yīng)用替莫唑胺治療前，可以及時(shí)、合理地干預(yù)HOXB9基因的非正常表達(dá)，以降低其對(duì)治療的抵抗力。然而本研究中的樣本很少，其結(jié)論缺乏臨床證據(jù)證明。因此本項(xiàng)研究的可信度需要通過(guò)今后的進(jìn)一步相關(guān)研究加以驗(yàn)證，以指導(dǎo)臨床患者的化療。

綜上所述，HOXB9基因與MGMT、P-gP、hMSH2和hMLH密切相關(guān)，是膠質(zhì)瘤患者采用替莫唑胺化療后耐藥的危險(xiǎn)因素。建議在進(jìn)行替莫唑胺化療前，可對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者進(jìn)行HOXB9基因表達(dá)監(jiān)測(cè)，對(duì)于表達(dá)非正常的患者，及時(shí)進(jìn)行針對(duì)性干預(yù)，有利于降低接受替莫唑胺化療的腦膠質(zhì)瘤患者的耐藥率。