廣東省佛山市新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查與基因突變分析

袁偉曦 邵巧儀 張澎怡 劉麗雅 劉海平

廣東省佛山市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心，廣東佛山 528000

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥是一種由于基因突變導致葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性降低的伴X 染色體連鎖不完全顯性遺傳性疾病[1-2]。目前，已知的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的致病突變已達240 種，以點突變為主。全球受葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥影響的人數已超4 億[3-5]。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患者多無明顯臨床癥狀，但常因藥物、食物、感染等誘發急性溶血，嚴重者會危及生命。因此，早篩查、早確診是有效預防葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥發作的重要手段。我國葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的發病率呈現“南高北低”的地域特點，廣東、廣西、海南、云南等地是本病的高發區[6-10]。了解當地新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的分子特征，可更好地推動該地區出生缺陷防控工作的開展。本研究通過收集廣東省佛山地區新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查數據及基因檢測情況，旨在了解本地區新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因突變的分布特征，為本地區新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的防控提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇廣東省佛山市婦幼保健院新生兒疾病篩查中心轄區內的各助產機構2019 年1 月至2020 年12 月出生的156 227 名新生兒為研究對象，其中男83 978 名，女72 249 名。

1.2 研究方法

1.2.1 主要檢測試劑及儀器 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶測定試劑盒（廣州市豐華生物工程有限公司）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因檢測試劑盒（PCR+導流雜交法）（廣東凱普生物科技股份有限公司）、全自動熒光免疫分析儀AutoTRFIA-4（廣州市豐華生物工程有限公司）、PCR 擴增儀（杭州博日科技股份有限公司）、醫用核酸分子雜交儀HB-2012A（廣東凱普生物科技股份有限公司）。

1.2.2 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查 收集于新生兒出生2～7 d 采集其足跟血所制作的干血片，采用葡萄糖-6-磷酸脫氫酶測定試劑盒（熒光分析法）和全自動熒光免疫分析儀AutoTRFIA-4 檢測其葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性，所有實驗操作均嚴格按照試劑盒及儀器操作說明書進行。樣本測定值≤2.20 U/gHb，判斷為初篩陽性，提示存在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏或減少的情況；樣本測定值＞2.20 U/gHb，判斷為初篩陰性[11]。

1.2.3 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因檢測 召回初篩陽性者，經監護人同意后采集其末梢血進行基因檢測。制作干血片，撕取9 mm×9 mm 干血片進行DNA 提取、PCR 擴增、雜交，讀取膜條上的基因檢測結果。所有操作步驟嚴格遵照試劑盒說明書進行。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因檢測試劑盒可檢測人類葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因6 個外顯子的14 種突變位點：c.95A ＞G、c.392G ＞T、c.487G ＞A、c.592C ＞T、c.871G ＞A、c.1024C ＞T、c.1311C ＞T、c.1360C＞T、c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.493A＞G、c.1387C＞T、c.1004C＞T、c.1381G＞A。若葡萄糖-6-磷酸脫氫酶初篩陽性者的導流雜交結果未見異常，則將該樣本送至廣東凱普生物科技股份有限公司進行一代測序（檢測葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因的外顯子2、5、6、9、11、12）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 24.0 對所得數據進行統計學分析，計數資料采用例數和百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 初篩人群特征

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥初篩陽性者6361 例，初篩陽性率為4.07%（6361/156 227）。其中男5683例，女678 例，男性人群中初篩陽性率為6.77%（5683/83 978），女性人群中初篩陽性率0.94%（678/72 249），男性初篩陽性率高于女性，差異有統計學意義（χ2=3378.22，P ＜0.05）。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥初篩陽性者中共召回2556 例，召回成功率為40.18%，其中575 例（男538 例，女37 例）同意進行葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因檢測。

2.2 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥初篩陽性的基因符合情況

575 例葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥初篩陽性者共檢出550 例攜帶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥突變基因，25 例未檢出異常；繼續進行一代測序，結果顯示有9 例檢出試劑盒檢測范圍外的c.517T＞C 突變，16例未檢出突變。葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查試驗（熒光分析法）的基因符合率為97.22%（559/575）。

2.3 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因突變分布特征

共檢出10 種基因突變類型：c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.95A ＞G、c.1311C ＞T、c.871G ＞A、c.1024C ＞T、c.392G＞T、c.517T＞C、c.1360C＞T、c.487G＞A。見表1。基因突變類型的檢出率排前3 位的分別為c.1376G＞T（31.07%）、c.1388G＞A（30.74%）、c.95A＞G（17.36%），占總突變的79.17%。c.517T＞C 突變的檢出率為1.49%。

表1 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因突變分布特征

3 討論

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥是我國南方地區的高發疾病，人群患病率為4.0%～20.0%[12]，本研究數據顯示本地區新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查陽性率為4.07%，與廣東省其他地區，如廣州（4.20%）、東莞（3.60%）、江門（4.14%）的篩查陽性率接近[13-15]。男性新生兒的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥初篩陽性率明顯高于女性，這可能是由于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥是伴X 染色體連鎖不完全顯性遺傳病，男性僅攜帶一條X 染色體，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因發生突變，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥篩查即為陽性；女性有2 條X 染色體，且X 染色體會出現隨機失活[16-17]，這使女性葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥雜合突變攜帶者的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性可表現為異常、正常或處于臨界值附近，這些酶活性表現為正常或臨界值附近的女性雜合突變攜帶者極易被漏診。有研究表明，女性雜合突變攜帶者暴露在氧化性刺激中時，也會出現急性溶血，危及生命健康[18]。

本研究通過對葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥初篩陽性者進行基因檢測，其基因符合率為97.22%，提示本地區選取的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性臨界值在篩查葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患者時具有較高的特異性。

本地區新生兒以c.1376G＞T、c.1388G＞A、c.95A＞G 3 種突變為主，這與我國最常見的3 種突變類型一致[11，19-21]。本研究發現本地區新生兒葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥初篩陽性者攜帶c.1311C ＞T 突變的比例達7.27%，且攜帶c.1311C＞T 半合子突變的新生兒的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性異常，提示c.1311C＞T 突變可能影響其活性。雖然c.1311C＞T 是同義突變，但其常復合同義突變c.1365-13T＞C，由于這兩個突變位點距離接近，可能干擾葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因的轉錄，從而導致葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患者酶活性的降低[22-24]。提示可將c.1311C＞T 作為導向指標，即當葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性異常者檢出c.1311C＞T 突變時，需對樣本進行進一步測序，以驗證該受檢者是否復合其他類型的突變，盡可能避免漏診葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥患者。此外，本研究發現本地區新生兒c.517T＞C 突變的攜帶率為1.49%，c.517T＞C 突變屬于葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥的Ⅱ類致病位點，在廣東省其他城市的檢出率為1.00%左右[25]，因此，在對廣東地區人群開展葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥基因檢測時，需將c.517T＞C 位點納入檢測范圍，避免漏診。

近年來，我國加大了對出生缺陷防控的投入力度，部分省市已對該地區新生兒推行免費新生兒疾病篩查政策，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶缺乏癥作為南方地區新生兒疾病篩查的重要項目，應制訂適合本地區的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性臨界值及基因檢測范圍，以更好地推動本地區新生兒出生缺陷防控事業的發展。