基于全鏈條的回收PET材料中非揮發性可遷移物的非靶向篩查及特征風險標志物的確定

楊 頡，馬 鑫，楊道遠，隋海霞*，杜振霞*

（1．北京化工大學 化學學院，北京 100029；2．國家食品安全風險評估中心，北京 100022）

聚對苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate，PET）因具有出色的阻隔性能而被廣泛用于礦泉水瓶、塑料茶包、餐盒餐具及食品包裝袋等[1－4]。近年來，塑料制品的一次性使用造成的持久性環境污染問題愈加嚴重，目前世界各國加強對塑料制品的管控以減少污染，同時通過回收利用使廢棄塑料轉化為有價值的新產品[5]。PET在自然條件下很難降解，從廢棄PET包裝材料變為再生PET包裝材料包括粉碎、漂洗、烘干、造粒和融熔加工等步驟[6]。回收PET（rPET）是否可再用作食品包裝材料有待進一步研究。

研究表明，隨著rPET在原材料中添加比例的提高，rPET材料的總遷移量呈線性上升趨勢，當rPET添加比例超過50%時總遷移量達到最大值，為原生PET材料總遷移量的5．6倍[7]。rPET中污染物來源為：一是消費后PET制品原先盛裝的內容物中水楊酸甲酯等小分子遷移進入PET[8]；二是PET在回收加工過程中引入的污染物以及由材料本身和添加劑降解產生的污染物[9]。

本研究首先采用溶解沉淀法提取碎片、粒料、瓶坯、瓶子4種不同生產階段rPET產品中的非揮發性小分子潛在遷移物，并根據法規探究rPET瓶子在6種食物模擬液中的遷移情況，結合超高效液相色譜－四極桿飛行時間質譜（UPLC－Q－TOF MS）篩查rPET產品中潛在遷移物及模擬液中遷移物，通過MS－DIAL（Mass spectrometry－data independent analysis software）軟件對不同生產階段的rPET產品進行標志物的快速篩選，確定各個階段的風險標志物。最后，通過TEST（Toxicity estimation software tool）軟件預測潛在遷移物及遷移物的大鼠經口急性毒性、發育毒性和致突變性，使用Toxtree軟件對潛在遷移物及遷移物進行Cramer分級，并對潛在遷移物及遷移物進行危害評估。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜－四極桿飛行時間質譜儀（UPLC－Q－TOF MS）：Waters Xevos G2－S QTOF（美國Waters公司），配有 ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm ×2．1 mm，1．7μm）；KH－100DE型超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；SHA－BA型水浴恒溫振蕩器（華普達儀器有限公司）；MTN－2800D型氮吹儀（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；GP225D型電子天平（Sartorius公司）；Milli－Q A10超純水器（美國Millipore公司）；0．22μm PTFE有機濾膜（津騰公司）。

1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇（HFIP，阿拉丁公司）；甲醇（色譜純，Fisher Chemical公司）；甲酸（純度>98%，ACROS公司）；乙醇（分析純，阿拉丁公司）；乙酸（分析純，北京化工廠）。超純水由Milli－Q A10超純水器制備；基于供應鏈的碎片、粒料、瓶坯、瓶子4種不同生產階段的rPET產品由供應商提供。

1.2 色譜與質譜條件

液相色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2．1 mm，1．7μm）；流動相：0．1%甲酸水溶液（A）－甲醇（B）；梯度洗脫條件：0～6 min，97%～0%A；6～10 min，0%A；10～10．5 min，0%～97%A；10．5～12 min，97%A；進樣量：1μL；流速：0．3 mL/min；柱溫：35℃。

質譜條件：檢測模式為MSE；電離模式為ESI+和ESI－；毛細管電壓為2．5 kV；錐孔電壓為30 kV（ESI+）、40 kV（ESI－）；離子源溫度為120℃；脫溶劑氣溫度為450℃；脫溶劑氣流速為1 000 L/h；錐孔氣流速為50 L/h；低能通道碰撞能為4 eV；高能通道碰撞能為20～40 eV；掃描范圍為m/z50～1 200；采用亮氨酸腦啡肽實時校正質量軸：556．2 766（ESI+），554．2 620（ESI－），每30 s切換1次進行質量數的校正。

1.3 溶解沉淀實驗

在玻璃離心管中分別稱取0．2 g 4種不同生產階段的rPET產品，加入2 mL HFIP溶解聚合物。40℃下靜置24 h，待聚合物溶解完全，加入4 mL甲醇并超聲1 h使聚合物完全沉淀。隨后，將混合物以3 000 r/min離心10 min，取上清液，并用1 mL甲醇洗滌殘留的聚合物沉淀，合并上清液。在溫和氮氣流下將上清液吹至近干，并用1 mL甲醇復溶后，經0．22μm PTFE針式濾器過濾，得到待測樣品。每種樣品設置2個平行，并分析相同程序的空白樣品。

1.4 遷移試驗

遷移試驗參照歐盟No．10/2011[10]及國家標準GB 31604．1－2015法規[11]進行。參考rPET制品的預期用途，選取10%（體積分數，下同）乙醇、3%乙酸、4%乙酸、20%乙醇、50%乙醇及95%乙醇食物模擬物，分別取10 cm2rPET瓶片放入盛有10 mL食物模擬物的玻璃離心管中。根據rPET預期接觸的最長時間并利用歐盟推薦的加速實驗采用60℃水浴加熱10 d作為遷移測試條件。將上述條件下得到的溶液于溫和氮氣流下吹干，1 mL甲醇復溶后經0．22μm PTFE針式濾器過濾，每個樣品設置2個平行，并分析相同流程的空白。

1.5 非靶向篩查流程

使用UNIFI軟件對潛在遷移物進行非靶向篩查。UNIFI科學信息系統是沃特世公司開發的一款可對液相色譜與高分辨質譜聯用數據進行采集、處理、瀏覽、報告生成等操作的軟件。Q－TOF MSE采集模式能在一次進樣下通過低能通道與高能通道分別得到物質的準分子離子峰及碎片信息。通過對比樣品與空白的色譜峰及質譜響應，判斷物質碎片信息來識別潛在遷移物，未知物的鑒定流程如圖1所示。

圖1 未知遷移物的鑒定流程Fig．1 Flow chart for identification of unknown migrants

1.6 MS－DIAL標志物篩選

通過MS－DIAL對不同生產階段的rPET產品進行標志物的快速篩選，以進一步確定各階段的風險物質。MS－DIAL是一款針對非靶向代謝組學的分析軟件，可快速篩選標志物。軟件設置如下：根據儀器類型選擇數據類型為“Centroid data”，離子模式為正離子。通過ABF Converter軟件將液質聯用的數據轉換為．ABF格式，樣品文件批量導入軟件中，并設置相應的樣品類型、分類ID、分析順序、進樣量（μL）信息。數據收集選項卡設置MS1的容差值為0．01 Da，MS2的容差值為0．05 Da，設置保留時間段為0～10 min，MS1和MS2的質量數分析范圍為50～1 200 Da。最大電荷數為2，多線程數為2。為篩選不同生產階段rPET產品的標志物，設置最小峰高為5 000，峰寬閾值為0．1。使用平滑方法可準確確定峰的左邊緣與右邊緣，分別設置平滑等級為3，最小峰寬為5。對于正離子模式，選擇加合離子為[+H]+、[+Na]+、[+K]+和[+NH4]+。

2 結果與討論

2.1 rPET瓶中潛在遷移物及遷移物的非靶向篩查

通過UPLC－Q－TOF MS分析了溶解沉淀處理后不同生產階段的rPET樣品及6種食物模擬物遷移樣品的潛在遷移物和遷移物。圖2顯示了不同生產階段rPET中潛在遷移物的總離子流色譜圖。在4種樣品及6組遷移實驗中共鑒定出包括有意添加物和非有意添加物在內的30種化合物（見表1）。

圖2 不同生產階段rPET中潛在遷移物的色譜圖Fig．2 Chromatograms of potential migrants in rPET at different production stages

表1 鑒定的潛在遷移物和遷移物Table 1 Identified migrants and potential migrants

（續表1）

4種不同生產階段rPET溶解沉淀樣品的非靶向篩查結果表明，在碎片、粒料、瓶坯、瓶子中均篩查出PET寡聚體、潤滑劑等物質。在瓶坯樣品中檢出的PET寡聚體種類最多，其次是瓶子和碎片樣品，在粒料樣品中檢測的PET寡聚體種類最少，可能是粒料被加工為瓶坯的過程中產生了新的PET寡聚體（見表1）。通過了解廠商整個rPET的回收加工過程，從粒料到瓶坯需經過300℃左右的高溫注塑，因此，推測在此過程中高溫導致PET發生降解，從而使瓶胚中的寡聚體種類增加。

潤滑劑在聚合物加工中可提高加工速度，降低聚合物與加工機械表面摩擦，減少能耗，提高產品質量。在4種生產階段的產品中均檢出脂肪酸酰胺類潤滑劑：硬脂酸酰胺、芥酸酰胺和二十酰胺，均為常見的聚合物潤滑劑且均被列入歐盟聚合物添加劑的準許清單[10]。在粒料和瓶胚中檢出的9，10-二羥基硬脂酸甲酯也是被歐盟批準使用的一種潤滑劑[10]。此外，粒料、瓶坯、瓶子中檢測到碎片中未檢出的潤滑劑十八烯酰胺、十六酰胺及二十烯酰胺，表明在rPET碎片到粒料加工過程中可能添加了潤滑劑。

此外，碎片中檢出非離子表面活性劑脂肪醇聚氧乙烯醚CxH2x+1－O－（CH2CH2O）n－H（x=12，n=2～11；x=14，n=2～9），其用作漂洗劑而在回收清洗過程中被引入。回收PET碎片需去除表面污染物，經過一系列清洗過程后才能用于生產粒料，漂洗劑為清洗階段的殘留。

2.2 MS－DIAL對不同生產階段rPET產品標志物的快速篩選

采用MS－DIAL對不同生產階段rPET產品標志物進行快速篩選。樣品中所有物質均在散點圖中顯示，圖中點的顏色代表不同色譜峰高度，其中紅色為較高色譜峰，藍色為較低色譜峰。MS－DIAL界面中柱狀圖為散點圖中某一點在各樣品中的色譜峰高度。脂肪醇聚氧乙烯醚的鑒定如圖3所示，圖3中柱狀圖部分1、2、3、4、5分別代表空白、碎片、粒料、瓶胚、瓶子，保留時間為7．01 min與7．31 min的一系列散點分別為C12H25－O－（CH2CH2O）n－H（n=2～11）、C14H29－O－（CH2CH2O）n－H（n=2～9）。通過對比峰高發現，只有rPET碎片樣品存在這兩種物質，故這兩種物質為碎片樣品的標志物。

圖3 不同標志物在MS－DIAL中的識別Fig．3 Recognition of different markers in MS－DIAL

限定p值<0．05篩選標志物，定義在所有樣品中色譜峰最高或最低為標志物，最終在所有樣品中篩選出7個標志物，如表2所示。

表2 確定的標志物Table 2 Identified markers

通過MS－DIAL分析進一步確定了全鏈條中不同回收生產階段的風險標志物。碎片中風險標志物為脂肪醇聚氧乙烯醚，而后續階段篩查中未檢出該漂洗劑，其僅在碎片中被發現，說明經歷全鏈條過程后漂洗劑被去除。粒料中風險標志物9，10-二羥基甲基酯硬脂酸為潤滑劑，塑料制品加工工藝擠出成型步驟需添加潤滑劑。推測在碎片加工為粒料過程中加入了新的潤滑劑。瓶坯中風險標志物為PET線性寡聚體，粒料到瓶坯的高溫注塑過程中寡聚體為主要風險標志物，可能由于高溫加工過程導致PET材料熱降解，產生更多的PET寡聚體。綜合分析結果，回收PET中最需要關注的風險標志物為PET寡聚體及潤滑劑。

2.3 全鏈條中PET寡聚體及潤滑劑的相對含量對比分析

對需要關注的PET寡聚體及潤滑劑的相對含量進行對比分析。潛在遷移物及遷移物中大部分為PET寡聚體，包括11種環狀寡聚體和7種線性寡聚體。寡聚體的色譜峰面積如圖4所示。PET寡聚體結構相似，其在質譜中響應差別較小，因此本文使用PET寡聚體的峰面積表示其相對含量。所有樣品中相對含量最高的環狀寡聚體為第二系列環狀二聚體TPA2－EG－DEG，線性寡聚體為第一系列線性二聚體（TPA－EG）2+H2O。環狀寡聚體的相對含量高于線性寡聚體，與文獻報道一致，這是由于PET合成過程中在形成環狀寡聚體及線性寡聚體之間存在熱力學平衡，而小分子量的環狀寡聚體更容易生成[12－13]。可以看出在回收PET全鏈條中，大部分PET寡聚體的相對含量增加，PET回收過程導致PET寡聚體增多。

圖4 對全鏈條不同生產階段中PET寡聚體的相對含量對比分析Fig．4 Comparative analysis of PET oligomers contents in different production stages in the whole chain

不同生產階段中潤滑劑的相對含量對比分析如圖5所示。潤滑劑的相對含量從碎片到瓶子的過程中有不同程度的增加。粒料中檢出3種碎片樣品未檢出的潤滑劑，推測從碎片到粒料的擠出加工過程中加入了潤滑劑，以降低加工時的摩擦力，提高流動性和加工效率。回收加工過程造成PET材料中潤滑劑相對含量及種類的增加。

圖5 對全鏈條不同生產階段中潤滑劑的相對含量對比分析Fig．5 Comparative analysis of lubricants contents in dif?ferent production stages in the whole chain

2.4 潛在遷移物及遷移物的危害評估

TEST軟件是由美國環境保護署開發的毒性評估軟件，基于定量結構活性關系（QSAR）原理評估化學品毒性。其包含幾種QSAR方法，如分層方法、小組貢獻法、單模型方法等，可對已知結構遷移物的急性毒性、發育毒性等不同毒性終點進行預測。使用TEST（v 5．1．1）軟件對潛在遷移物及遷移物的LD50、發育毒性和致突變性進行預測，預測方法為共識法，該法是在適用范圍內通過對分層方法、單模型方法、小組貢獻法和臨近值法的預測毒性取平均值得到預測值，對于已有動物試驗的遷移物，其LD50值取實驗值（見表3）。

表3 潛在遷移物和遷移物的危害評估Table 3 Hazard assessment of potential migrants and migrants

（續表3）

Cramer規則由Cramer等[14]提出，該規則基于化合物毒性與其結構相關的假設，可通過Cramer決策樹將化合物分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3類。其中Ⅰ級化合物具有較低的經口毒性，Ⅲ級化合物具有顯著毒性，Ⅱ級化合物的毒性則介于兩者之間。對不屬于DNA反應性致突變物和/或致癌物的潛在遷移物，用Toxtree（v3．1．0）軟件對潛在遷移物及遷移物進行Cramer分級，如表3所示。

TEST軟件分析發現，所有潛在遷移物和遷移物的致突變性均為陰性，即均不屬于DNA反應性致突變物和/或致癌物。而大部分酰胺類潤滑劑和PET寡聚體存在發育毒性，可能會對子代發育過程產生不良影響。使用Toxtree軟件對潛在遷移物和遷移物進行Cramer分級，PET線性寡聚體均被分為Cramer Ⅰ級，PET環狀寡聚體和酰胺類潤滑劑均為Cramer Ⅲ級。表明PET環狀寡聚體和酰胺類潤滑劑的毒性高于PET線性寡聚體，需要重點關注。

3 結 論

本文通過UPLC－Q－TOF MS對回收PET全鏈條中碎片、粒料、瓶坯、瓶子4種階段樣品進行了非靶向篩查，分析溶解沉淀法得到的不同階段樣品和歐盟及國家標準推薦的6種食物模擬物對rPET瓶進行的遷移測試樣品，共提取出30種潛在遷移物和遷移物，主要為PET寡聚體和酰胺類潤滑劑。在碎片樣品中檢出清潔過程引入的漂洗劑，發現在回收加工中高溫導致PET寡聚體的增加。利用MS－DIAL進一步確定全鏈條各個階段的風險物質，篩選出7種標志物。最后利用TEST和Toxtree軟件對遷移物進行危害評估，結果表明部分物質的發育毒性為陽性，PET環狀寡聚體和酰胺類潤滑劑均為Cramer Ⅲ級物質，需在回收PET全鏈條生產過程中引起關注。下一步需要結合遷移水平開展暴露評估，并進行最終的風險表征，為rPET是否能夠用于生產食品接觸材料及制品提供科學依據。