基于UPLC－QTOF MS的食品接觸用回收PET中非揮發性有機物的非靶向篩查

董 犇，吳學峰，郝天英，李 丹，曾 瑩，吳思亮，寇筱雪，黎梓城 ，陳 勝 ，3，林勤保 ，3，鐘懷寧 ，3*，鄭建國 *

（1．廣州海關技術中心，國家食品接觸材料檢測重點實驗室（廣東），廣東 廣州 510623；2．暨南大學包裝工程研究所，廣東普通高校產品包裝與物流重點實驗室，廣東 珠海 519070；3．中國食品接觸材料可持續發展工作組，廣東 廣州 510070）

聚對苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate，PET）具有良好的透氣性、光澤度、穩定性和成型性等性能[1]，被廣泛應用于食用油、礦泉水、碳酸飲料等多個食品包裝領域[2－3]。目前，PET瓶已居塑料食品包裝領域之首[4]。但是，PET具有極強的化學惰性，是一種生物不可降解的材料，容易造成嚴重的環境污染和資源浪費。因此，對PET食品包裝的回收利用成為當今國內外解決塑料垃圾，保護生態安全的重大舉措，具有巨大發展前景[5－7]。

食品包裝用回收PET（rPET）材料的化學物質和污染物比原生PET材料更加復雜[6]。一方面由于有不同種類的化學物質用于食品包裝用rPET材料的生產和處理，如生產環節使用的單體、樹脂、添加劑、聚合反應助劑等，而在生產過程中，受工藝、溫度、時間、輻照等因素的影響，材料和制品中有可能遷移出很多化學物進入食品[8]；另一方面，在PET產品的消費和機械回收再生處理中，可能會引入一些外來污染物，如食物油脂、飲料殘留、家庭清潔劑和農藥等，這些物質可能殘留在rPET中，并最終遷移到食品中[9]；上述這些物質包括雜質、副反應、分解和降解產物以及環境污染物等，國際統稱為非有意添加物（NIAS）[10]。而在非有意添加物中，不少物質已被確認為毒性明確或風險較高的高關注污染物，如芳香族伯胺、全氟多氟化合物、環內酯、礦物油[11]等；當含有上述物質的rPET用于食品接觸材料時，可能會遷移到食品中，從而威脅消費者的身體健康[12]。歐洲EC NO 282/2008和美國FDA21CFR174．5均規定了從源頭開始，rPET必須滿足一系列安全指標要求才可用于制造食品包裝[6,13]。但國內對食品接觸用rPET材料的研究才剛剛起步，本課題組近期發表了對于食品接觸用rPET材料中的有意添加物（IAS）和NIAS等物質遷移量的分析檢測及安全評估方面的研究[14]。在政府監管層面，由于擔心rPET的污染物來源不明而可能導致食品安全風險，目前為止尚未允許rPET用于生產食品接觸材料；國內關于rPET中IAS/NIAS分析標準或方法尚未見報道。規范分析技術的缺失導致難于開展食品接觸用PET的系統性風險監測和評估工作，因此，亟需開展針對中國rPET材料中IAS/NIAS檢測技術的相關研究。

對rPET中檢出的NIAS進行準確識別非常困難。許多NIAS物質，特別是非揮發性有機物均無標準物質或未包含在任何可用的數據庫中，導致無法準確、高效地鑒定檢出物；而軟電離（提供母離子信息）和串聯高分辨率質譜（提供子結構信息）的使用可為未知物的定性提供豐富的信息。超高效液相色譜?四極桿飛行時間高分辨質譜（UPLC－QTOF MS）兼具上述功能而被視為未知物分析的有力手段，已成功用于食品接觸材料中IAS或NIAS的檢測[12,15－17]。這也為開展rPET中IAS/NIAS殘留物的分析提供了一種新的技術路徑和工具。本文使用UPLC－QTOF MS技術對食品接觸用rPET制品中的非揮發性有機物進行非靶向篩查和分析。研究結果表明，所建立的方法具有快速、靈敏等優點，在食品接觸用rPET中非揮發性污染物的非靶向篩查方面具有十分廣泛的應用前景。研究結果可為食品接觸用rPET材料的風險評估、標準制修訂和風險管理評估工作提供有益參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

1290－6546高效液相色譜－串聯高分辨飛行時間質譜儀（美國Agilent公司）；ME204電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Milli－Q超純水發生器（美國Millipore公司）；AS 7240BT超聲波發生器（天津奧特賽恩斯公司）；FM200高速旋轉研磨儀（廣州市厚普儀器有限公司）。

鄰苯二甲酸丁芐酯－D4（BBP－D4）購自Dr．Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇均為色譜純，購自Fisher公司。六氟異丙醇（純度>99%，HFIP）購自麥克林公司；測試所需的初步清洗后的瓶片和粒子等PET產品由供應商提供。

1.2 標準溶液的配制

BBP－D4標準品用甲醇配制成質量濃度為1 000 mg/L的單標儲備溶液，再用甲醇稀釋成質量濃度為10 mg/L的標準中間溶液。

1.3 樣品制備及前處理

取適量的原生PET顆粒于高速旋轉研磨儀中粉碎成粉末狀，用作前處理方法優化的測試樣品。

均勻穩定樣品的制備：取適量的rPET瓶片于高速旋轉研磨儀中粉碎，用作條件優化和測試的樣品。

在潔凈的玻璃瓶中分別稱取0．2～1．0 g待測樣品，加入適量的HFIP溶解聚合物，待溶解完全后，加入甲醇并超聲1 h使聚合物完全沉淀。隨后，將混合物以9 000 r/min離心10 min，取上清液，用1 mL甲醇洗滌離心管壁和殘留的沉淀，將所得上清液合并。在溫和氮氣流或旋轉蒸發條件下將上清液吹至近干，并用1 mL甲醇復溶。將復溶后的溶液通過0．22μm濾頭過濾，得到待測樣品。每種樣品設置兩個平行，并分析全過程的空白樣品。

1.4 UPLC－QTOF MS儀器條件

對于不揮發性物質采用UPLC－QTOF MS在數據依賴型采集（DDA）模式下測試，具體條件如下：流動相：A相：0．1%甲酸水，B相：甲醇；洗脫梯度：0～1．5 min，5%B；1．5～25 min，5%～98%B；25～32 min，98%B；32～32．1 min，98%～5%B；32．1～35 min，5%B；柱溫：40℃；進樣量：3μL；流速：0．3 mL/min；掃描模式：全一級離子掃描與全二級離子掃描，電離模式為ESI+和ESI?；毛細管電壓正模式為4 000 V，負模式為3 500 V；鞘氣流速：11 L/min；掃描范圍：一級離子：50～1 100m/z；二級離子：20～800m/z；二級離子碰撞能量：10、20、40 eV。

對UPLC－QTOF MS的測試數據，未知化合物通過Agilent Mass Hunter Qualitative Analysis軟件進行分析。通過實驗室自建食品接觸材料數據庫，使用非靶向篩選的方法根據軟件的“化合物發現”和“鑒別”功能篩選出候選分子式，并與未知化合物的測試譜圖信息進行比較分析。

檢出物質的定量通過半定量方法進行。標準品盡可能選擇與待定量化合物的物理化學性質相近且不與待定量化合物發生化學反應的物質。本文半定量測試選擇鄰苯二甲酸丁基芐酯（BBP－D4）和對苯二甲酸作為內標物。

2 結果與討論

2.1 前處理方法的優化

樣品前處理技術在復雜樣品的分析過程中起著非常重要的作用，合適的前處理方法可提高痕量目標物在樣品中的濃度和消除樣品基質對分析的干擾[18]。本文首先通過測試原生PET樣品的加標回收率（50μL 10 mg/L的BBP－D4），對樣品的前處理方式進行了優化。

2.1.1 沉淀溶劑的選擇沉淀溶劑是影響前處理效率的重要因素之一，如產生沉淀過快，則容易包裹待測物質；如產生沉淀較慢或不產生沉淀，則需要消耗大量的溶劑，既增加實驗溶劑消耗，也降低了測試效率。實驗考察了幾種常見溶劑（丙酮、甲醇、正己烷）對BBP－D4加標回收率的影響。結果如表1所示，當用甲醇作沉淀溶劑時，加標回收率最高。這是因為甲醇為沉淀溶劑時，沉淀是顆粒狀固體，更有利于待測物質的檢出。其余兩種溶劑中正己烷產生沉淀的速度較慢，而丙酮產生的沉淀為片狀固體。增加或減少溶解溶劑HFIP的量，回收率均會降低，這可能是由于溶劑量較多時，延長了氮吹時間，導致標準物質損失較多；而溶劑量較少時，再沉淀時易包裹標準物質，造成回收率較低。此外，本文也考察了文獻方法[19]的實驗結果（表1，序號7和8），獲得加標回收率為55．0%和64．0%。因此，實驗選擇甲醇作為沉淀溶劑，溶解溶劑HFIP的用量為10 mL。

表1 不同種類沉淀溶劑及其用量對BBP－D4回收率的影響Table 1 Effects of different types and amounts of precipitation solvents on recoveries of BBP－D4

2.1.2 溶劑去除方式的優化兩組平行實驗的溶劑分別采用45℃氮吹至近干和45℃水浴加熱、旋轉蒸發儀去除溶劑至近干兩種方式處理后進行測試，BBP－D4的加標回收率分別為66%和46%。但由于旋蒸加熱和高真空條件下導致加標物質損失較多。因此，選擇45℃氮吹作為溶劑去除方式。

2.1.3 樣品量的優化待測樣品的用量對非有意添加物的篩查和定性非常重要。樣品量過高時，可能會對靈敏度非常高的四極桿飛行時間質譜造成污染；樣品量過低時，易造成物質漏檢或定性不準。實驗考察了待測樣品的質量分別為0．2、0．4、1．0 g時對檢出物質的影響，結果顯示，隨著樣品量的增加，檢出物質的質譜峰強度增加不明顯。因此，實驗選擇0．2 g作為測試樣品量。

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 測試方法的優化DDA法是高于設定豐度閾值的母離子才會被送到碰撞室中，經高能碰撞產生二級質譜。該方法的優點是其的二級質譜相對比較干凈，有利于未知物的準確定性分析；在非數據依賴型采集（Data－independent acquisition，DIA）中，一級質譜中所有離子均會進入碰撞室，經高能碰撞后產生二級質譜，該方法的缺點是一級質譜中所有離子同時產生碎片，導致二級質譜復雜，很難找到母離子和碎片離子的對應關系，不利于未知物的定性分析；MS模式是離子以全通過的模式通過四極桿得到待測物的一級質譜圖。實驗考察了3種方法對檢出物質個數和峰面積的影響，結果表明DDA法檢出物質的個數和峰面積之和最優，這主要是由于用于定性的質譜譜庫均通過DDA法建立。因此，本文選擇DDA法作為測試方法。

2.2.2 流動相的優化UPLC－QTOF MS法常用的流動相是0．1%甲酸水－乙腈或0．1%甲酸水－甲醇體系[19－20]。對未知物的篩查需要同時進行正、負離子模式的電離，而已有文獻對于非有意添加物的篩查大多以0．1%甲酸水體系為主[14,19]，因此，本方法水相選擇0．1%甲酸水。而對于有機相，實驗分別選擇甲醇和乙腈進行測試，結果顯示使用甲醇為有機相時檢出物質數量和峰面積最佳。綜上，本方法最終選擇0．1%甲酸水－甲醇體系作為最佳流動相。

2.2.3 洗脫梯度的優化合理的洗脫梯度可縮短分離時間，提高分離效果。在選擇洗脫梯度時，從水相到有機相的轉換速度需合適才能達到較好的分離效果。實驗考察了測試時間分別為3、50 min時，5種洗脫梯度對檢出物數量和峰面積的影響。結果顯示，按“1．4”洗脫梯度時檢出物質最多。因此，本方法選擇上述梯度進行測試。

2.3 方法學驗證

采用樣品加標方式來考察方法的精密度和準確度。分別在經相同處理過程的不同空白樣品中添加3個不同質量濃度（0．05、0．5、5 mg/L）的BBP－D4。每個加標水平平行測定6次。結果表明，BBP－D4的回收率為66．0%～80．4%，相對標準偏差（RSD）為1．3%～5．1%（見表2）。實驗結果表明本方法具有較好的準確度和精密度，滿足篩查需求。

2.4 定性分析

在優化條件下，通過UPLC－QTOF MS分析了溶解沉淀處理后的rPET樣品中潛在未知物的殘留量。共鑒別出含3個有意添加物和27個非有意添加物在內的30種化合物（見表3）。圖1顯示了rPET樣品中潛在未知物的總離子流色譜圖。3個有意添加物中，1，2-環己烷二羧酸二異壬基酯和鄰苯二甲酸二甲酯[21]是塑料中常用的增塑劑[22]，對苯二甲酸是生產PET的主要原料[1]。27個非有意添加物中，季戊四醇三丙烯酸酯和季戊四醇四丙烯酸酯廣泛應用在涂料、油墨、粘合劑、光聚合物反應等領域[23]，可能是回收過程中引入的污染物；棕櫚酸乙酯廣泛用作香料香精、軟化劑、潤滑劑[24]，但未見報道在PET生產制備過程中使用；實驗檢出環狀寡聚物10個、線性寡聚物15個，含量范圍為0．038～4．92 mg/kg。實驗結果表明檢出的寡聚物種類比較多，部分寡聚物的含量也相對較高，可能是由于從粒料到瓶子需要經過大約300℃的高溫注塑處理，在此高溫過程中聚合物可能發生降解所致。此外，研究表明原生PET中也有寡聚物檢出[19－20,25]，經過回收再生處理后寡聚物的量和種類是否有明顯的增加尚需進一步研究。

表3 rPET樣品中鑒定出的化合物Table 3 Identification of screening compounds in rPET samples

（續表3）

圖1 樣品篩查物質的TIC圖Fig．1 TIC chromatograms of screening compounds

2.5 樣品主成分分析（PCA）

PCA作為一種無監督的模式識別方法，主要是通過對數據進行降維處理和從整體上直觀顯示各組樣品的差異。為區分不同來源rPET瓶片檢出物質的差異，采集不同廠家的rPET瓶片（C組和N組），測試數據通過安捷倫Profinder 10軟件進行預處理，結果導入SIMCA14．1軟件，選用PCA－X模式進行分析。結果顯示，正離子模式下rPET瓶片的C組和N組沿t[1]軸出現了明顯分化，表明檢出物質差異較大（圖2）；而負離子模式下部分樣品差異較小。以上結果表明該方法在正離子模式下的檢出物可區分不同來源的rPET瓶片。為進一步找出有重要貢獻的顯著性差異成分，根據變量投影重要性（VIP）>1．2與S－plots圖中p（corr）>0．60的標準篩選差異化合物，通過文獻檢索、數據庫匹配及裂解規律，共鑒定出15個顯著性差異成分（如表4）。其中介酸酰胺常作為各種塑料、樹脂的抗粘劑和滑爽劑[26]；1，3：2，4-二（3，4-二甲基亞芐基）-D-山梨醇作為成核劑廣泛應用于各種常見塑料中[27]；磷酸三辛酯作為增塑劑廣泛使用于PET等各種塑料加工過程中[28]；其余線型和環狀寡聚物12個。根據以上結果，推測不同地域廠家生產的rPET瓶片中寡聚物等物質含量隨著所處環境不同而有顯著差異。

圖2 不同樣品在PCA－X模式下的Scores圖Fig．2 Scores diagrams of different samples under PCA－X mode

表4 篩選出顯著性差異成分列表Table 4 List of significant of difference ingredients

3 結 論

本研究建立了一種UPLC－QTOF MS測定rPET瓶片中非揮發性物質的非靶向篩查方法，優化了不同沉淀溶劑、溶劑去除方式、樣品量等前處理條件和流動相、洗脫梯度以及質譜數據采集方法等測試條件，并結合化學計量學分析了檢出物化學成分的變化，區分了不同來源的兩組rPET瓶片中檢出物質的差異。方法前處理簡單、靈敏度高、分離能力強，可用于rPET瓶片中非有意添加物的非靶向篩查的相關研究，也可為政府和行業開展食品接觸用rPET的再生利用以及安全風險評價提供技術支持。