JNK 調控阻塞性睡眠呼吸暫停合并高血壓模式研究

張 可，陳 靜，周 燕

（1.桂林醫學院附屬醫院呼吸與危重癥醫學科/呼吸疾病實驗室，廣西 桂林 541000；2.泰安市中心醫院呼吸內科，山東 泰安 271000）

阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）是一種發病率日益增高的睡眠呼吸疾病，其病理生理學特點為間歇性低氧，與高血壓密切相關[1]。血管重構與高血壓密切相關，而血管內皮細胞表型轉化是血管重構的重要環節[2]，阻斷其發生發展是治療高血壓的重要途徑，越來越受到臨床的關注[3]。研究表明[4]，氧化應激會激活JNK 信號通路，是體內高血壓進展的重要病理生理途徑，介導著血管重構的發生。本研究通過觀察間歇性低氧能否調控JNK信號通路引起高血壓，并探討其可能作用機制，旨在為治療OSA 合并高血壓提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗動物購自廣西醫科大學-廣西實驗動物中心，雄性8 周齡SD 大鼠共36 只，體重160～200 g，隨機均分為四組：常氧對照組、常氧干預組、間歇性低氧組、間歇性低氧干預組，各9 只。

1.2 實驗儀器與試劑 低壓氧艙；動脈血壓測量儀；光學顯微鏡；基因擴增儀：TC020A-230V；穩壓電泳儀：DYY-6D型；蛋白轉膜系統：TE22型；數碼凝膠成像分析系統：JS-780型；數字圖像分析系統：IPP-5.0 形態學分析軟件；Trizol RNA 提取及逆轉錄試劑盒；JNK 阻滯劑：SP600125[5]；JNK-1 山羊抗小鼠多克隆抗體；BCA 蛋白濃度測定試劑盒。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 將造模組大鼠放置于低氧艙內，每日固定時間循環充入氮氣和氧氣8 h，具體方法為首先充入氮氣30 s，在30 s 內將氧濃度下降至4%～6%，保持該氧濃度1 min 使大鼠處于缺氧狀態，然后充入氧氣10 s，使氧濃度恢復至21%，保持20 s，持續2 min。常氧對照組及常氧對照干預組大鼠將充入氣體更改為空氣，進行相同處理，該處理持續12 周；常氧干預組及間歇性低氧干預組大鼠每天以30 mg/kg 的SP600125 進行灌胃，對剩余兩組大鼠行生理鹽水灌胃。

1.3.2 血壓測定 在實驗過程中，每周固定時間進行對鼠尾平均動脈血壓（MAP）進行測定，測量3 次血壓后取3 次血壓的平均值。

1.3.3 病理學檢測 不同組別大鼠處死后分離腹主動脈，固定標本后進行染色，觀察腹主動脈病理學改變，并測量各組腹主動脈中膜厚度（MT）、管腔直徑（LD）、兩者比值以及中膜膠原纖維面積百分比。

1.3.4 Western blot 法檢測JNK-1 蛋白在大鼠腹主動脈組織中的表達 稱取各組大鼠腹主動脈10 mg 左右，經研磨-裂解-震蕩-離心后吸取上清液測定蛋白濃度，最后通過Western blot 檢測腹主動脈中JNK-1 蛋白水平。

1.3.5 RT-PCR 法檢測JNK-1mRNA 在大鼠腹主動脈組織中的表達 取各組大鼠腹主動脈組織稱重，選取等重量組織在低溫條件下研磨至粉末狀，按說明依次進行RNA 提取-測定RNA 純度及完整度-RNA 逆轉錄-RT-PCR 進行JNK-1mRNA 目的基因片段擴增-RT-PCR 產物電泳。目的片段的相對表達量=JNK-1mRNA 的灰度值/β-actin 的灰度值。

1.4 統計學處理 用SPSS 21.0 軟件進行數據處理，計量資料以（）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。檢驗水準α=0.05，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血壓變化情況 與同周齡常氧對照組大鼠比較，自造模2 周后，間歇性低氧組大鼠血壓升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與同周齡間歇低氧組大鼠比較，間歇性低氧干預組大鼠血壓下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；間歇性低氧干預組大鼠血壓與同周齡常氧對照組大鼠比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠血壓變化情況（，mmHg）

表1 各組大鼠血壓變化情況（，mmHg）

注：與常氧對照組比較，*P＜0.05；與間歇性低氧組比較，△P＜0.05

2.2 各組大鼠腹主動脈病理結果比較 各組大鼠腹主動脈內膜MT、LD、MT/LD 及中膜膠原纖維面積百分比變化情況見表2。與間歇性低氧組比較，間歇性低氧干預組大鼠腹主動脈無明顯內膜破壞，動脈中膜血管平滑肌細胞（VSMCs）數量下降（P＜0.05），腹主動脈未見中層彈性膜明顯增加，層次排列較整齊，壁層厚度較統一，層次較分明，未見平滑肌纖維破裂；與同培養時間常氧干預組大鼠比較，間歇性低氧干預組大鼠腹主動脈中膜血管平滑肌細胞（VSMCs）層數無明顯增加或減少（P＞0.05），見圖1。

圖1 各組大鼠腹主動脈病理結果比較

表2 各組大鼠腹主動脈內膜各指標變化情況（）

表2 各組大鼠腹主動脈內膜各指標變化情況（）

注：與常氧對照組比較，*P＜0.05；與間歇性低氧組比較，△P＜0.05

2.3 各組大鼠腹主動脈JNK-1mRNA RT-PCR 表達比較 四組均于138 bp 處出現JNK-1mRNA 表達條帶，其中間歇性低氧組表達量高于常氧對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；在兩間歇性低氧組中，間歇性低氧干預組JNK-1mRNA 表達量低于間歇性低氧組，差異有統計學意義（P＜0.05）；與常氧干預組比較，間歇性低氧干預組JNK-1mRNA 表達量增加，但差異無統計學意義（P＞0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠腹主動脈JNK-1mRNA RT-PCR 表達比較

2.4 各組大鼠胰腹主動脈JNK-1 蛋白Westernblot結果比較 與常氧對照組比較，間歇性低氧組JNK-1 蛋白表達水平增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與常氧對照組比較，間歇性低氧干預組JNK-1 蛋白表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與常氧干預組比較，間歇低氧干預組JNK-1 蛋白表達水平增加，但差異無統計學意義（P＞0.05），見圖3。

圖3 各組大鼠胰腹主動脈JNK-1 蛋白WesternBlot 結果比較

3 討論

OSA 是一種發病率日益增長的呼吸睡眠疾病，目前我國OSA 患者已達6600 萬[6]。OSA 患者在睡眠時反復出現上氣道完全或部分堵塞，進而出現間歇性低氧表現，是高血壓的獨立危險因素[7]。研究表明[8]，OSA 主要通過激活交感神經系統、激活RASS系統、增加氧化應激、損傷內皮及全身炎癥反應等方式導致高血壓的發生。另有研究表明[9，10]，高血壓的主要病理特點為血管內皮功能障礙，血管收縮增加和血管重構，而VSMCs 表型轉化與血管重構密切相關，其主要通過免疫及炎癥反應進行調節。由此推測，OSA 可能通過某種信號通路對VSMCs 進行調控，進而影響血管重構及高血壓的發生。

c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）信號轉導通路是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號轉導通路中的重要家族成員[11]。JNK 蛋白激酶由由三種蛋白激酶基因編碼[12]，其中JNK1-3 通過磷酸化激活后，不同JNK 異構體通過特定模式與特定的蛋白底物激活、結合及進行磷酸化[13]。JNK 分別由JNK 激酶1、2 激活，并從細胞質向細胞核轉移，進而與細胞核內的ATF2 和c-Jun 尾端的63、73 位絲氨酸結合，引導相關基因與蛋白的表達，廣泛參與體內的炎癥及免疫反應[14]。

目前研究JNK 信號及OSA 相互關系的實驗不多，已有資料顯示在大腦海馬區的損傷中二者關系密切。相關研究表明[15]，大鼠在間歇性缺氧環境下海馬區的JNK 磷酸化水平上升，誘導細胞的凋亡，進而對機體的學習記憶功能產生影響。丙二醛（malondialdehyde，MDA）及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是氧化應激的主要標志物[16]。間歇性低氧使機體MDA 表達水平上升及SOD 表達水平下降，同時導致JNK 表達水平上升，證實間歇性低氧會引導氧化應激反應的出現，進而上調JNK 基因及相關蛋白表達，對大鼠神經系統造成損害并破壞記憶功能[17]。另外，隨著間歇性低氧持續時間增加，大鼠體內炎癥反應亦隨之增強，體內組織的相關JNK 基因及蛋白表達水平隨之上升，由此推斷JNK信號通路參與了OSA 患者炎癥反應，并與炎癥反應的發展密切相關。

當前有關JNK 信號通路作用于血管重構的研究較少。已有研究表明，血管重構與VSMCs 的表型轉化密切相關，VSMCs 作為動脈中膜的主要細胞成分，可以根據生理形態及功能的不同，分為收縮型和合成型[18]。當受到免疫炎癥反應刺激后，VSMCs 發生轉化，其表達形式發生轉變，由收縮型轉化為合成型，進而介導VSMCs 增殖和轉移，細胞外基質（extracellular matrix，ECM）合成增加，最終導致血管重構，這也是高血壓的重要病理特征之一[19，20]。因此，JNK 信號通路作為的炎癥反應信號通路，其可能參與了腹主動脈中VSMCs 的表型轉化，進而介導血管重構的產生。

本研究結果顯示，與常氧對照組大鼠比較，間歇性低氧組大鼠MAP 升高，而間歇性低氧干預組大鼠MAP 較間歇性低氧組大鼠下降，且與常氧干預組MAP 水平比較無差異，說明JNK 信號通路調控OSA 高血壓的變化。本研究發現，間歇性低氧組大鼠腹主動脈出現血管壁炎性細胞浸潤、彈性纖維損害、平滑肌細胞丟失及內膜厚度增加等血管重構現象，而間歇性低氧干預組中腹主動脈血管重構現象不明顯，說明JNK 信號通路參與OSA 合并高血壓大鼠的腹主動脈血管重構過程。另外，Western blot及RT-PCR 結果顯示，間歇性低氧組大鼠腹主動脈組織中JNK mRNA 及JNK 相關蛋白的表達水平較常氧對照組增高，但與間歇性低氧干預組大鼠對比，JNK mRNA 及JNK 相關蛋白的表達水平下降，這進一步提示JNK 信號通路參與了OSA 合并高血壓大鼠的血管重構現象，結合間歇性低氧組大鼠的血管重構現象，進一步說明了JNK 信號通路通過調節JNK mRNA 及JNK 相關蛋白的表達水平，影響腹主動脈血管重構，進而調控OSA 合并高血壓大鼠的血管重構情況。因此，抑制JNK 信號通路可以抑制腹主動脈血管重構，進而抑制高血壓的發生發展。

綜上所述，間歇性低氧會激活JNK 信號通路，上調JNK 信號通路的mRNA 及蛋白表達水平，引起高血壓，并介導大鼠腹主動脈出現的血管重構。阻斷JNK 信號通路能抑制OSA 所致的血壓升高及血管重構現象，這可能成為治療阻塞性睡眠呼吸暫停合并高血壓的新思路。