桑椹花青素合成相關基因的鑒定及其功能研究

王 真

（中國海洋大學，山東青島 266100）

桑椹營養價值異常豐富，富含大量花青素，對于清除人體自由基、延緩衰老有著十分積極的意義。桑椹果實中大量的花青素由葉綠素轉化而來，作為一種黃酮類化合物，桑椹花青素分子當中存有高度分子共軛體系，合成過程比較復雜，眾多的結構基因及調控基因參與其中，各種代謝酶是花青素形成的關鍵，對其基因合成途徑進行研究能夠實現分子水平的調控，從生物學角度完成果品改良，提升桑椹中的花青素含量，從而創造更多的營養價值以及經濟效益。

1 花青素合成途徑相關基因研究

1.1 花青素合成途徑

第1階段：在該階段的苯丙烷途徑中，苯丙氨酸作為花色素苷的生物合成前體，是整個合成過程的基礎，苯丙氨酸在苯丙氨酸解氨酶（PAL）的作用調控之下發生氨基脫去反應，形成反式肉桂酸，在肉桂酸-4-羥化酶（C4H）以及4-香豆酰CoA連接酶的催化作用下，經過一連串的酶促反應而形成次生代謝中間物質香豆酰輔酶A[1]。

第2階段：該階段為類黃酮代謝的關鍵，香豆酸輔酶A與丙二酰輔酶A經由查爾酮合酶（CHS）以及查爾酮異構酶（CHI）的催化作用下形成柚皮素，在黃烷酮-3-羥化酶基因活性的調控之下將香豆酸輔酶A轉化為類黃酮母核結構。

第3階段：該階段為花青素的初步合成階段，由多種酶共同參與調控，主要表現為二氫黃酮醇還原酶（DFR）經過催化作用形成無色花色素，再在花青素合成酶（ANS）及雙加氧酶（LDOX）的催化調控下完成無色花色素經過氧化脫水實現到有色的過程，同時在類黃酮3-葡糖基轉移酶（3GT）的調控下形成結構穩定的花色素苷，形成青素的基本碳骨架[2]。

第4階段：該階段為花青素基本碳骨架的修飾階段，有羥基化、甲基化、糖基化以及酰基化等多種形式，在一個或者是多個點位之間完成，不同的修飾過程完成之后可以形成不同的花色素，經過修飾后的花青素無論在穩定性、光吸收度還是水溶性等方面都得到了明顯的提升，花青素苷經過積累以轉運谷胱甘肽轉移酶（GST）為介質匯集儲存于液泡。

1.2 花青素合成代謝基因

1.2.1 花青素合成代謝相關結構基因

（1）查爾酮合成酶基因（CHS）。作為類黃酮合成代謝過程中遇到的首要酶基因，其表達量決定了花青素顏色變化，CHS的關鍵作用在于催化4-香豆酸CoA與丙二酰CoA合成查爾酮，為類黃酮碳骨架的形成構建基礎[3]。作為一個多基因家族，CHS基因編碼結構在不同科目的植物之間表現出的保守性較為明顯，植物生長過程中CHS缺乏，則會導致類黃酮難以產生。

（2）查爾酮異構酶基因（CHI）。作為類黃酮合成的關鍵酶，能夠完成對類黃酮當中化合物含量的調節，CHI的基因編碼是一種功能性單體，其豐度的變化對于植物體內的黃酮物質含量有著直接的影響，即便在不通過植物當中也有較高的氨基酸序列相似性，但與其他蛋白質有所差異。

（3）黃烷酮3-羥化酶基因（F3H）。作為類黃酮代謝調控的重要基因，F3H是一種關鍵結構酶，該基因呈現出一定的底物特異性，是作用于合成過程中的重要分支，在其催化作用下可以產生二氫黃酮醇類物質，但其作為一種加氧酶故在反應時需要Fe2+、O2等輔助因子的參與。不同植物當中的F3H表達模式以及基因拷貝數皆不同。

（4）二氫黃酮醇-4-還原酶基因（DFR）。作為花色素合成后期的關鍵酶，DFR的作用在于催化二氫黃酮醇促使其形成無色花色素，屬于還原酶家族具備單基因編碼特性，可以在NADPH的輔助下還原羰基為羥基，DFR的調控作用異常復雜具有一定的保守性，不同植物的不同生長時期和不同組織部位DFR的基因表達特性不同。

（5）花色素苷合酶基因（ANS）。作為花青素合成過程中的有色化合物，ANS屬于雙加氧酶家族，能夠將無色原花青素催化氧化轉換為有色，其作用于花青素合成的最后階段，是一種小基因結構，具有明顯的組織特異性。

1.2.2 花青素合成代謝相關調控基因

（1）MYB轉錄因子。作為一種DNA融合蛋白質，MYB結構域是一個高度保守的DNA序列，既具有特定的結合活性，也具有特定的序列特異性，在MYB結構域含有大約52種氨基酸，具有保守特征的氨基酸殘基可以使MYB蛋白質折疊為不同的螺旋-螺旋-轉角-螺旋結構，MYB轉錄因子既可以完成植物花青素合成正向調節，也可以對植物內的MYB蛋白質進行負調節。

（2）堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子（bHLH）。作為植物中的第二大轉錄因子家族，bHLH最大的功能在于類黃酮以及花青素的合成調節，該類轉錄因子的蛋白結構較為保守，每個bHLH基序都含有超過60種的氨基酸殘基，包含DNA結合區以及HLH兩個保守結構域，分別由大量堿性氨基酸以及疏水氨基酸組成[4]。

（3）WD40轉錄因子。作為一類大蛋白家族，WD40機構具有高度保守的特點，含有4～16個不等基元序列，同時每個基元序列大約有41種氨基酸組成。整個花青素的合成過程中，WD40蛋白位于同一個進化分支，能夠同bHLH轉錄因子或MYB類轉錄因子在共同的激活或者抑制作用下調控結構基本的表達，完成對花青素合成的調控。

2 桑椹高通量鏈特異性轉錄組測序文庫的構建及測序

2.1 不同發育時期桑椹轉錄組測序文庫的構建

分別對青果期桑椹（MG）、紅果期桑椹（MR）以及紫熟期桑椹（MP）構建轉錄組測序文庫，并利用Illumina Solexa測序技術完成鏈特異性測序分析，利用Trinity軟件將所得到的數據完成拼接組裝，利用BLAST軟件分別完成GO、KOG等數據庫的基因序列對比，參照分析結果與轉錄本注釋結果完成差異表達的lncRNAs以及mRNAs的鑒定。

2.2 不同發育時期桑椹中lncRNA表達譜

分別對不同時期的lncRNA進行數據統計，同時完成上下頻數據統計，結果表明lncRNA比mRNA水平離散度更低，同時在生物學的基礎上分析lncRNA靶基因功能，利用熒光定量PCR分析發現桑椹花青素合成途徑中相關基因表達與花青素含量正相關。

3 桑樹Mul-UC3GT基因在花青素合成過程中的作用及其表達調控分析

3.1 克隆Mul-UC3GT基因測定同源度

以轉錄組提供的核苷酸序列為基礎，以桑椹cDNA為模板，以PCR技術為手段得到Mul-UC3GT克隆基因，并利用NCBI軟件對比同源蛋白質中植物氨基酸序列，發現Mul-UC3GT蛋白質川桑的UGT蛋白質所含有的氨基酸同源度高達98%，但與擬南芥序列所含有的氨基酸同源度僅僅只有29%，同時通過MEGA 5.0軟件構建同源蛋白質的系統進化樹，結果表明川桑矢車菊素-3-O-葡萄糖苷-2-O-葡糖基轉移酶與Mul-UC3GT具備較近的親緣關系。

3.2 獲得轉Mul-UC3GT基因擬南芥

以Mul-UC3GT基因核苷酸序列為基礎，設計特異性引物并完成PCR擴增完成其與克隆載體的連接轉化為感受態完成陽性克隆質粒提取，以BamHI以及Sall為根本進行陽性質粒的雙酶切驗證，構建Mul-UC3GT基因植物表達載體，并將其轉化為GV3101感受態細胞，完成對擬南芥野生型植株的浸染。對陽性植株進行培養篩選，并進行DNA模板提取和PCR擴增，獲取轉Mul-UC3GT基因擬南芥，接下來完成RNA提取，反轉錄為cDNA，利用熒光定量PCR分析驗證轉Mul-UC3GT基因在轉Mul-UC3GT基因中的豐度。通過對轉基因植株與野生植株的對比發現，轉基因植株花青素含量更高[5]，表明Mul-UC3GT基因的桑椹花青素的合成過程中具備正調控作用。為驗證該結論，特對野生植株與轉基因植株中的二氫黃酮醇-4-還原酶DFR以及無色花青素雙加氧酶LDOX表達量進行分析，結果表明轉基因植株中二者的表達量更高，同時也發現花青素修飾過程中的糖基化作用過程中的轉移酶明顯降低，證明了Mul-UC3GT基因的正調控作用。

4 Mul-CHS基因在花青素合成過程中的作用及其表達調控分析

4.1 克隆Mul-CHS基因完成同源化分析

整個過程同克隆Mul-UC3GT基因測定同源度一致，分析后發現Mul-CHS蛋白質與川桑的CHS蛋白質所含有的氨基酸同源度高達98%，與金絲桃、榴蓮等植物中的查爾酮合成酶CHS的同源性也高達90%以上，說明CHS具有較強的氨基酸序列保守性。通過MEGA 5.0軟件構建同源蛋白質的系統進化樹，表明Mul-CHS與川桑CHS具備較近的親緣關系。

4.2 獲得轉Mul-CHS基因擬南芥

同獲得轉Mul-UC3GT基因擬南芥過程，一致獲取轉Mul-CHS基因擬南芥。通過對轉基因植株與野生植株的對比發現，轉基因植株葉柄紫紅色較為明顯，而野生植株依舊為綠色，經過一系列的測定表明轉基因植株花青素含量更高，表明Mul-CHS基因的桑椹花青素的合成過程中具備正調控作用。為驗證該結論，特對查爾酮合成酶CHS在花青素合成上游催化過程中的基因表達量進行分析，同時完成了對肉桂酸-4-羥化酶C4H以及肉桂酰輔酶A連接酶4CL基因表達量的判斷，結果表明轉基因植株中肉桂酸-4-羥化酶C4H以及肉桂酰輔酶A連接酶4CL表達量明顯降低，證明了Mul-CHS基因在花青素合成過程中的上游具備負調控作用、Mul-CHS基因在花青素合成過程中的下游具備正調控作用。

5 結語

經過對植物花青素合成途徑的相關基因進行研究分析發現，植物花青素合成的途中受到結構基因和調控基因的影響，不同基因有著不同的功能。通過對桑椹中Mul-UC3GT、Mul-CHS基因的克隆以及轉基因的建立分析發現，二者對花青素的合成有著一定的調控作用。不過值得注意的是，無論是何種植物其花青素的合成皆是在諸多基因相互合作、相互關聯之下完成的，轉錄因子以及生長環境的影響也不容忽視，想要實現桑椹著色以及培育質量的提升還需從基因工程入手。