林蛙油摻假分子生物學檢測方法研究進展

陳宇飛，楊 柳

（吉林工商學院糧食學院，吉林長春 130507）

林蛙又稱雪蛤，屬于兩棲綱無尾目蛙科[1]。林蛙油也稱蛤蟆油、蛤士蟆油，為林蛙雌蛙輸卵管，其主要成分是蛋白質，富含18種氨基酸[2]。林蛙油具有補腎益精、養陰潤肺、健腦益智和平肝養胃功效用于調節陰虛體弱、神疲乏力、心悸失眠、盜汗不止和癆嗽咳血等癥狀[3]。

哈爾濱師范大學生命學院趙文閣教授協同東北林業大學野生動物學院多名教授科學命名，把原來稱做中國林蛙、中國林蛙長白山亞種的林蛙，統一命名為東北林蛙。并明確東北林蛙所產的油為“大油”，黑龍江林蛙所產的油為“小油”，其他蛙油均為“偽油”或“假油”[4]。近年來捕捉野生林蛙的人越來越多，人為的濫捕亂殺，使野生的林蛙和林蛙油越來越缺乏，導致林蛙油價格非常昂貴。一些不法商家以青蛙油、中華大蟾蜍油、牛蛙油和明太魚精巢等冒充林蛙油，牟取暴利。常用于林蛙油摻假檢測的方法有傳統方法和儀器檢測方法。傳統檢測方法有基源鑒別、性狀鑒別、組織學鑒別和顯微鑒別等[5]。儀器檢測方法有凝膠電泳法、紅外光譜法、原子吸收光譜法等[6]。隨著分子生物學技術的發展，PCR、LAMP等技術的應用，使得林蛙油摻假檢測能夠更加快速、準確。本文對東北林蛙油摻假檢測的分子生物學方法進行概括，以期為快速、準確地進行東北林蛙油摻假檢測提供參考。

1 指紋圖譜法

指紋圖譜是基于食品的固有品質特性，運用光譜、色譜等現代儀器檢測得到的能反映該食品內部特征的圖譜，具有整體性、系統性、特征性和穩定性的特點[7]。李津明等[8]利用高效液相色譜法，測定10批林蛙油產品，建立指紋圖譜。色譜條件為Dimonsil C18分析柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm），柱溫：25 ；流動相：乙腈-水（50∶50），分析時間60 min。在該色譜條件下，可以檢出17個相應位置穩定的共有峰，可作為確定林蛙油的指標峰。白雪媛[9]通過高效液相色譜法對林蛙油樣品進行研究，建立了林蛙油指紋圖譜的共有模式，最后確定林蛙油指紋圖譜的色譜條件為：Dimonsil C18（5μ 100A TiANHE?TH 1025 250 mm ×4.6 mm，S/N:06L25514）；流動相：乙腈-0.5%磷酸水溶液；柱溫：室溫；檢測波長：209 nm；進樣量為15 μL。在己篩選的色譜條件下，35 min內可完成林蛙油指紋圖譜的檢測，該方法具有良好的專屬性、準確度、精密度、重復性和穩健性，測定范圍在25～100 μg/mL。姜玢[10]以正二十四烷峰為參照物峰，確定20個共有峰，建立了中國林蛙卵油GC數字化指紋圖譜。獲得了以色譜指紋圖譜指數F等42參數對中國林蛙卵油GC指紋圖譜的超信息特征數字化評價結果和系統指紋定量法定量鑒別結果。姜玢等[11]建立了中國林蛙卵油高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）數字化指紋圖譜，以亞油酸為參照物峰，確定21個指紋峰，獲得了可以判別其質量的重要數字化信息，所建立的中國林蛙卵油HPLC數字化指紋圖譜方法穩定、可靠，可用于中國林蛙卵油的質量控制。

2 PCR法

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種將待檢驗的DNA序列于生物體細胞外在酶促作用下進行擴增，設計不同物種特定基因片段的引物大量體外擴增DNA，通過得到的PCR產物而鑒別物種的技術[12-13]。李小清[14]將長白山地區的19個蛤蟆油樣品進行了基源分析，研究了基于蛤蟆油近源物種的線粒體全基因序列中線粒體呼吸鏈特異性基因隔序建立蛤蟆油的特異性PCR鑒定方法，該方法首次建立基于線粒體基因間隔序列特異性PCR技術的蛤蟆油鑒別方法，可進行定量分析，無需通過基因測序，降低了檢測成本。聶丹丹等[15]對已報道的東北林蛙、黑龍江林蛙、黑斑側褶蛙、牛蛙和中華蟾蜍的COI及cytB基因為模板進行了研究，應用PCR擴增東北林蛙COI基因，通過測序確定東北林蛙亞種，建立了東北林蛙及其產品的鑒別方法。董瑤等[16]以林蛙和林蛙油為原料，以線粒體DNA上cytB為研究對象，應用PCR擴增cytB，并測序確定了林蛙品種，建立了林蛙種屬及林蛙油基源鑒定方法。

3 “LAMP+微流控”法

環介導等溫擴增技術（Loop- mediated Isothermal Amplification，LMAP）是Notomi等人在2000年建立的一種新的體外擴增特異DNA片段的分子生物學技術，是在65 恒溫條件下進行核酸快速擴增，利用2條特異性內引物和2條特異性外引物識別靶基因上的6個區域，其DNA聚合酶具有鏈置換活性，數十分鐘即可完成核酸擴增[17]。

LMAP技術是一種特異性強、靈敏度高、快速簡便的等溫核酸擴增技術，近年來在核酸檢測領域有著廣泛的研究和應用[18]。郭建平等[19]利用LAMP技術建立了基于顏色判定的快速、靈敏的金黃色葡萄球菌檢測方法，將反應時間縮短至60 min。張萌等[20]以棗轉錄間隔區（Internal Transcribed Spacer，ITS）為靶序列，建立了real-time環介導等溫擴增技術檢測棗花蜜源成分的方法，最低檢測限為≥1 pg/μL。肖劍等[21]基于環介導等溫擴增技術建立了快速檢測植物蛋白飲料中大豆成分的方法，并以PCR方法為參比方法，對32種植物蛋白飲料進行檢測應用驗證，結果表明，該方法特異性強，32種植物除大豆外，其他均未發生擴增，穩定性好，最低檢出限為0.1%（以質量分數計），可以為植物蛋白飲料大豆成分摻雜摻假提供參考。

微流控芯片又稱芯片實驗室，是微型全分析系統的核心，它是把化學和生物等領域中所涉及的樣品制備、反應、分離和檢測等基本操作單元集成或基本集成到一塊很小的芯片（幾平方厘米）上，由微通道形成網絡，可以控制流體貫穿整個系統，用以取代常規化學或生物實驗室的各種功能的一種技術平臺[22]。

微流控芯片在食品安全檢測領域得到了廣泛應用。苑寶龍等[23]設計制作了一種可以用于農藥殘留現場快速檢測的微流控芯片，7 min內即可實現對克百威和樂果的快速檢測，最低檢出限分別為0.02 mg/L、0.06 mg/L，對克百威加標回收率為95.0%～103.3%，制作的芯片在1個月內的穩定性較好。鞠鶴鵬等[24]建立了一種結合LAMP和微流控技術檢測沙門氏菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌3種食源性致病菌的方法，制成的微流控芯片具有較好的特異性，3種致病菌的檢測敏感性均可達到100 cuf/mL，實現了對3種致病菌的快速檢測。周新麗等[25]研制了一套用于牛、羊、豬、鴨和雞源性成分快速檢測的離心式微流控芯片系統，每次可同時檢測5個樣本，每個樣本可同時檢測5種指標，能夠在30 min內實現半定量檢測，具有快速、自動、高通量的特點。王衛芳等[26]研究了林蛙油摻假LAMP檢測方法、試劑盒以及微流控基因芯片的制備，通過對比林蛙油的多種檢測方法，得出以分子生物學為基礎的LAMP檢測方法具有較高的先進性和簡便性，微流控芯片多重檢測具有低成本、高通量的優越性，為林蛙油分子生物學檢測提供了新的檢測手段。

4 結語

隨著越來越多的分子生物學技術在東北林蛙摻假檢測中進行應用，定能克服傳統檢測方法檢測靈敏度低、檢測周期長等缺點。東北林蛙油摻假LAMP檢測試劑盒和微流控芯片等產品的研發，也將為食品檢驗檢疫、海關出入境等部門進行東北林蛙油摻假檢測提供幫助。