參苓白術丸對原發性高膽固醇血癥豚鼠模型的影響

張雨田 王 紅 屈子怡 楊朝帥 馮彬彬 王悅豪

1.天津中醫藥大學研究生院，天津 300000；2.天津中醫藥大學第二附屬醫院普通外科，天津 300000

2018 年我國心血管疾病死亡率居首位，占居民疾病死亡構成的40%以上[1]。而高膽固醇血癥是引起動脈粥樣硬化最重要的危險因素[2]。雖然目前他汀類、PCSK9、依折麥布等已被廣泛應用于臨床，但仍存在一些不足[3]。因此需要不斷探索來發現新的、實用且有效的藥物來治療高膽固醇血癥。近年來有學者認為痰濕體質與高膽固醇血癥等代謝性慢性病的發生具有密切的關系[4-5]，脾氣健運才能將津液吸收、傳輸到全身各臟腑。脾不健運則津液失于輸布，釀濕為痰，痰濕造成氣血運行受阻，進而化生血濁，阻滯于脈道。本研究選取治療健脾祛濕的代表藥物參苓白術丸作為實驗藥物，以高脂飲食建立原發性高膽固醇血癥豚鼠模型，旨在觀察參苓白術丸對高膽固醇血癥豚鼠模型的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

普通級Hartley 豚鼠，雄性，80～90 d，體重250～300 g，由北京隆安實驗動物養殖中心提供[動物生產許可證編碼：SCXK（京）2014-0003]。實驗動物自由飲水、進食。高脂飼料（10.0%豬油，0.5%膽固醇，89.5%基礎飼料）及普通飼料由北京科澳協力飼料有限公司提供[許可證號：SCXK（京）2014-0010]。實驗過程遵循天津醫藥研究院和國家有關實驗動物保護與使用的準則，并經天津醫藥研究院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 藥物

參苓白術丸（天津中新藥業集團股份有限公司樂仁堂制藥廠，批號：B094067，規格：6 g/100 粒）；依折麥布片[MSD Pharma（Singapore）Pte Ltd，批號：ZEZPA16001，規格：10 mg/片]。

1.3 試劑與儀器

血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）測定試劑盒[積水醫療科技（中國）有限公司，批號：822RBO、826RCO、824RLN、823RAO]；總膽汁酸測定試劑盒及蛋白定量測試盒[南京建成生物工程研究所，批號：E003-2]；尼曼-匹克C1 型類蛋白1（Niemann-Pick C1 like 1，NPC1L1）、三磷酸腺苷結合盒轉運體G5（ATP binding cassette transport G5，ABCG5）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；肝臟X 受體α（liver X receptor α，LXRα）、膽固醇酰基轉移酶2（acyl-CoA cholesterol acyltransferase 2，ACAT2）測定試劑盒（上海藍基生物科技有限公司，批號：E02A0863、E02A0677）。

KHB ST-360 型酶標儀（上海科華生物工程股份有限公司）；日本OLYMPUS 公司BX53 型偏光顯微鏡、DP73 型顯微鏡攝像頭、SZ2-STS 型體視顯微鏡。

1.4 實驗方法

1.4.1 實驗動物分組、造模及給藥 豚鼠適應性喂養1 周，將其分為對照組，模型組，依折麥布組，參苓白術丸高、中、低劑量組，每組10 只。對照組給予普通飼料，其余組均給予高脂飼料，在室內溫度為20～25℃，相對濕度為40%～70%，明暗周期12 h/12 h 的條件下喂養8 周建立原發性高膽固醇血癥豚鼠模型。

造模4 周后開始藥物灌胃干預，給藥體積為10 ml/kg。依折麥布組予依折麥布混懸液（1 mg/kg），參苓白術丸高、中、低劑量組分別予17.00、8.50、0.85 g/kg，模型組和對照組給予等體積生理鹽水，1 次/d，連續4 周。實驗期間各組動物均自由飲水攝食。

1.4.2 實驗動物取材 末次給藥后各組禁食不禁水12 h，戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，靜置30 min 后，3000 r/min 離心10 min，-80℃凍存備用；取肝、末端回腸、遠端空腸組織置-80℃保存，另取肝組織于10%中性甲醛溶液固定，行組織病理學HE 染色觀察；結扎膽囊管并完整取下膽囊，收集膽囊膽汁并觀察成石情況同時行膽囊膽汁測定。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 血液生化指標檢測 采用全自動生化分析儀檢測各組豚鼠血清中TG、TC、HDL-C、LDL-C 的含量。

1.5.2 膽汁TC、總膽汁酸測定 測定采用酶比色法及酶顯色法，按試劑盒說明進行。膽汁-20℃保存。

1.5.3 HE 染色法觀察肝臟組織形態學變化 肝臟組織置于10%中性甲醛溶液固定24 h，逐級乙醇脫水、透明，浸蠟，包埋，切片，HE 染色，光鏡下觀察肝組織病理形態學變化。

1.5.4 酶聯免疫吸附試驗法測定小腸組織NPC1L1、ABCG5、ACAT2、LXRα 的表達 取各組動物小腸組織，提取組織裂解液（離心半徑10 cm，8000 r/min，離心15 min），配置試劑，繼續按照檢驗步驟進行，在反應終止后5 min 內用酶標儀在450 nm 波長依序測量各孔的光密度（optical density，OD）值，將樣本的OD值代入方程式，計算出樣本濃度。

1.6 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗；兩組間比較采用t 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清TG、TC、HDL-C 及LDL-C 水平比較

與對照組比較，模型組血清TG、TC、LDL-C 水平均升高，差異均有統計學意義（P ＜0.05）。與模型組比較，參苓白術丸低劑量組TG 水平降低，差異有統計學意義（P ＜0.05）；參苓白術丸中劑量組血清TG、LDL-C 水平均降低，HDL-C 水平升高，差異均有統計學意義（P ＜0.05）；參苓白術丸高劑量組血清TG、TC、LDL-C 水平均降低，HDL-C 水平升高，差異均有統計學意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 各組血清TG、TC、HDL-C 及LDL-C 水平比較（mmol/L，）

表1 各組血清TG、TC、HDL-C 及LDL-C 水平比較（mmol/L，）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。TG：甘油三酯；TC：總膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇

2.2 各組膽汁TC、總膽汁酸水平比較

與對照組比較，模型組膽汁TC、總膽汁酸水平均升高，差異均有統計學意義（P ＜0.05）。與模型組比較，參苓白術丸中、高劑量組膽汁TC、總膽汁酸水平均降低，差異均有統計學意義（P ＜0.05）。見表2。

表2 各組膽汁TC、總膽汁酸水平比較（）

表2 各組膽汁TC、總膽汁酸水平比較（）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。TC：總膽固醇

2.3 各組肝臟病理組織學觀察

對照組肝臟組織基本正常；模型組可見彌漫性大泡性脂肪變，肝組織內廣泛的肝細胞氣球樣變、少量炎癥細胞浸潤和點狀細胞壞死；依折麥布組脂肪變性顯著減輕；參苓白術丸中、高劑量組脂肪變性及肝細胞氣球樣變顯著減輕；參苓白術丸低劑量組肝細胞脂肪樣變性改善較模型組不明顯。見圖1。

圖1 肝臟病理組織學圖片（HE 染色，200×）

2.4 各組NPC1L1、ACAT2、ABCG5 及LXRα 水平比較

與對照組比較，模型組NPC1L1、ACAT2、ABCG5、LXRα 水平均升高，差異均有統計學意義（P ＜0.05）。與模型組比較，參苓白術丸中、高劑量組NPC1L1、ACAT2、LXRα 水平均降低，ABCG5 水平均升高，差異均有統計學意義（P ＜0.05）。見表3。

表3 各組NPC1L1、ACAT2、ABCG5 及LXRα 水平比較（ng/g，）

表3 各組NPC1L1、ACAT2、ABCG5 及LXRα 水平比較（ng/g，）

注：與對照組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP ＜0.05。NPC1L1：尼曼-匹克C1 樣蛋白1；ACAT2：膽固醇酰基轉移酶2；ABCG5：三磷酸腺苷結合盒轉運體G5；LXRα：肝臟X 受體α

3 討論

中醫無“高膽固醇血癥”病名，但一般認為其在“痰濁”“痰濕”等范疇中[6]。中醫理論認為該病病機本質乃“本虛標實”，本以“脾虛”為要，標以“濕濁”為主[7]。故治療應從健脾祛濕入手，作為健脾祛濕經典方劑，參苓白術丸由蓮子肉、薏苡仁、陳皮、砂仁、桔梗、白扁豆、茯苓、人參、白術、山藥、甘草組成。現代藥理學研究發現，參苓白術丸的多個有效成分對脂質代謝失調均有明顯的改善和調節作用[8-11]。因此，本研究選取不同劑量的參苓白術丸探究其對原發性高膽固醇血癥豚鼠的影響，為臨床使用參苓白術丸調節膽固醇代謝提供實驗依據。

小腸從食物中吸收的膽固醇占人體攝取膽固醇總量的50%[12]。在此過程中NPC1L1、ACAT2、ABCG5、LXRα 起到重要作用[13-19]。有研究[20]顯示，阻斷NPC1L1的內吞可以抑制膽固醇進入吸收細胞；ACAT 作為細胞內唯一可以催化膽固醇酯合成的酶，當抑制小腸中ACAT2 時，可阻斷小腸對飲食來源膽固醇的攝取[21]；ABCG5 除了可促進膽固醇從小腸上皮細胞運至腸腔隨糞便排出，還能促進膽固醇逆轉運，促進肝臟將膽固醇分泌入膽汁排出體外[22-24]；LXRα 可以抑制小腸NCP1L1、上調ABCG5 的表達，減少腸道對膽固醇的吸收。上調毛細膽管的肝細胞中ABCG5 的表達，增加肝膽固醇向膽汁中的直接排放；促進限速酶CYP7A1，將肝膽固醇轉化為膽汁酸；調節SREBP-1c 將膽固醇轉換成脂肪酸等方式[25-28]。因此調控這些蛋白的表達，對治療原發性高膽固醇血癥具有重要意義。

本研究結果顯示，與對照組比較，模型組血清TG、TC、LDL-C 水平均升高（P ＜0.05），提示原發性高膽固醇血癥動物造模成功[29-30]。與模型組比較，參苓白術丸中、高劑量組NCP1L1、ACAT2、LXRα 水平均下降，ABCG5 水平均升高（P ＜0.05），提示參苓白術丸中、高劑量組可以下調高膽固醇血癥豚鼠模型小腸NCP1L1、ACAT2、LXRα 水平，上調ABCG5 水平。

本研究結果顯示，與模型組比較，參苓白術丸中、高劑量組TG、LDL-C 水平及膽汁TC、總膽汁酸含量均降低（P ＜0.05），且肝臟的脂肪變性、肝細胞氣球樣變也較模型組改善。提示參苓白術丸中、高劑量組可以改善高膽固醇飲食所導致的原發性高膽固醇血癥，減輕肝臟細胞脂肪樣變。其可能的機制是參苓白術丸通過下調NCP1L1、ACAT2，上調ABCG5 來降低膽固醇水平；若要明確該結論，還需要阻斷該信號通路，檢測參苓白術丸是否具有降脂作用來進一步確定。

本研究結果顯示，與模型組比較，參苓白術丸中、高劑量組LXRα 水平降低（P ＜0.05）。在高膽固醇條件下，LXRα 上調SREBP-1c 的表達，而SREBP-1c 過表達將使大量固醇轉換成脂肪酸，超出人體代謝能力后會引起肝臟脂肪變性，最終形成非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）[31-33]。參苓白術丸中、高劑量組可以通過下調LXRα 水平改善原發性高膽固醇血癥豚鼠模型的NAFLD。

綜上所述，參苓白術丸中、高劑量可以降低NPC1L1、ACAT2 及LXRα 表達，上調ABCG5 水平；能夠降低高膽固醇血癥豚鼠模型的血脂水平，改善膽汁TC 和總膽汁酸濃度，減輕肝臟脂質沉積。今后本課題組將進一步明確參苓白術丸影響原發性高膽固醇血癥豚鼠膽固醇水平的機制，為參苓白術丸治療高脂血癥提供更有力的實驗數據支持。