番茄抗枯萎病分子機制研究進展

成 璐，歐陽壽強

（揚州大學園藝與植物保護學院，江蘇 揚州 225009)

番茄是全球最主要的蔬菜作物之一，其營養豐富，栽培技術成熟，在我國被廣泛種植。番茄枯萎病是由土傳真菌病原物尖孢鐮刀菌番茄專化型（Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici，Fol）通過侵染番茄根系引起的番茄病害。Fol病原菌致病力強且發病范圍廣泛，被研究者列為世界上第3大土傳病原真菌，所導致的番茄枯萎病給番茄生產造成了巨大損失[1-2]。尖孢鐮刀菌的寄主范圍非常廣泛，可引起茄科、瓜類、豆科及花卉等100多種植物枯萎病的發生。在現代農業生產中，設施蔬菜瓜果類作物由于在相對封閉的環境下生長，特殊的小氣候雖有利于農作物生長，但也促進了各種病蟲害的滋生，加之長年連作，土壤中病原菌的數量不斷增加，導致設施栽培蔬菜的枯萎病發生越來越嚴重。由尖孢鐮刀菌番茄專化型病原菌引起的枯萎病是番茄生產上最嚴重的真菌病害之一，研究番茄—尖孢鐮刀菌互作的分子機制對番茄農業生產具有重要的理論意義。本文根據國內外番茄抗枯萎病的病原及其致病機制、寄主抗病機制進行了總結概述，以期為番茄抗枯萎病分子育種及綠色防控提供參考和借鑒。

1 番茄枯萎病病原研究進展

枯萎病病原菌有細菌性病原菌和真菌性病原菌2種，本文主要闡述的番茄枯萎病病原菌為真菌性病原菌[3]。尖孢鐮刀菌為真菌性病原，屬半知菌類（Fungi Imperfecti）、梗孢目（Moniliales）、痤孢科（Tuberculariaceae）、鐮刀菌屬（Fusarium）[4]。早在1940年，研究人員就發現并提出番茄枯萎病真菌病原菌存在生理小種的理論[5]，番茄枯萎病病原菌主要包括2個生理小種：1號生理小種和2號生理小種，屬近等位基因系品種，廣泛分布于美國大部分地區以及以色列、日本、加拿大、澳大利亞等地，而我國主要以1號生理小種為主[6-8]。番茄枯萎病主要是由尖孢鐮刀菌番茄專化型病原菌引起的，通常尖孢鐮刀菌只能在一種植物宿主上引起枯萎病[9]，其孢子形態主要有3種：小型分生孢子、大型分生孢子和厚垣分生孢子[10]。枯萎病病原菌主要以菌絲體、分生孢子、厚垣孢子的形式在農具、種子及土壤中傳播。侵染時，孢子萌發管或菌絲體通過根部進入植物體內，在根皮層細胞間侵染至木質部，再通過木質部導管蔓延至莖稈及頂部，最終導致植株維管堵塞、葉片氣孔關閉、葉片萎蔫，甚至整株死亡[11]。

2 尖孢鐮刀菌致病機制

尖孢鐮刀菌成功侵入寄主植物需要經過一系列過程：首先通過根部侵入寄主植物，在此過程中會分泌毒素、細胞壁降解酶等物質，降低寄主防御機制并在寄主體內定植，寄主植物感知信號，葉片由下而上變黃，最后致使植株萎蔫死亡[12]。

2.1 尖孢鐮刀菌定植機制

2.1.1 尖孢鐮刀菌分泌致病毒素

毒素是植物病原真菌重要的致病因子，尖孢鐮刀菌侵入寄主后會分泌相關毒素物質，如鐮刀菌屬真菌（Fusarium）分泌的非專化型毒素鐮刀菌酸（5-丁基-2-吡啶甲酸，Fusaric acid，FA）能增加寄主細胞膜透性，降低粒體活性氧含量，阻止ATP合成，損傷植物根系，影響種子萌發，最終導致寄主植物死亡[13-14]，但低含量毒素能誘導植物合成植保素[15]。在尖孢鐮刀菌番茄專化型中發現了編碼F-box毒素蛋白基因FRP1，它的缺失使Fol的毒力下降，侵入能力也受到一定影響[16]。

2.1.2 細胞壁降解酶破壞植物細胞壁

在病原菌侵染寄主植物致病的過程中，病原菌可通過分泌一系列細胞壁降解酶，侵入寄主植物的細胞壁，侵染植物使其發病。鐮刀菌分泌的細胞壁降解酶主要包括果膠酶（Pectic enzyme）、纖維素酶（Cellulase）、半纖維素酶（Hemi cellulase）、角質酶（Cutinase）和其他酶類，如蛋白酶（Protease）等[17]。一般情況下，植物鐮刀菌的單個細胞壁降解酶基因缺失對鐮刀菌毒力沒有太大影響[18-19]，其原因在于鐮刀菌可能通過調節其他細胞壁降解酶的表達來彌補這個基因功能；若同時敲除2個或多個編碼細胞壁降解酶的基因，突變株的致病力則會顯著降低[20-21]。引起小麥赤霉病的禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）的PG1和Xyl基因分別編碼Pg（內切多聚半乳糖醛酸酶）和調節因子用于調控木聚糖酶的產生，單基因敲除Pg1或xyr1，其酶活性均明顯降低，但敲除菌株致病力卻未減弱，若將2個基因同時敲除，則發現其毒力明顯降低[22]；此外，敲除調控細胞壁降解酶功能的上游基因也能導致突變株的致病力變弱，如SNF1（sucrose non-fermenting 1）基因編碼的SNF1蛋白激酶可以解除碳分解代謝阻遏現象，當敲除SNF1后，相關細胞壁降解酶的表達水平降低，從而鐮刀菌對甘藍及擬南芥的致病力變弱[23-24]。將番茄枯萎病菌中編碼F-box蛋白的基因Frpl敲除后，突變體中編碼果膠酶的PL1、PG1、PG2基因和編碼木聚糖酶的XYL2、XYL5基因的表達降低，CWDES基因的表達下降，侵染能力減弱，影響病菌在植物根部的定植和萌發[25-26]。

2.1.3 尖孢鐮刀菌定植

尖孢鐮刀菌侵入寄主植物后，需要在寄主體內定植才能進行下一步的浸染。真菌細胞外信號調節激酶（YERK1）亞家族成員促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）Fmk1被敲除后，其突變體菌株在番茄果實組織上的侵入性生長減少，且果膠酸裂解酶編碼基因Pl1轉錄水平顯著降低，其分生孢子不能分化為穿透菌絲，導致番茄根附著定植能力嚴重受損[27]。Fow1是第1個被鑒定對植物真菌病原毒力起決定性作用的線粒體蛋白基因，其所編碼的蛋白是尖孢鐮刀菌定植番茄組織所必需的[28]。Fow2所編碼的鋅指蛋白家族中的真菌轉錄因子參與調控尖孢鐮刀菌病原體侵染宿主的過程，還影響了病原菌侵入和定植植物組織的能力[29]。

2.2 信號傳導機制

病原菌在侵染植物時，會根據寄主植物的特點來調整自身的代謝過程，以達到成功侵染寄主的目的，而這些調控都是在信號傳導系統的指令下完成的。病原菌信號傳導途徑主要有2個：環腺苷酸單磷酸-蛋白激酶A（cAMP-PKA）和促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）信號途徑，前者主要調控病原菌孢子的形成，而后者主要調控細胞延伸，兩者均參與病原菌的侵染過程[30]。真菌具有羥基化類固醇的能力，在尖孢鐮刀菌等一些絲狀真菌中，黃體酮誘導一種酶系統，將化合物轉化為毒性較低的羥基化產物。如Δfgb1突變體菌株中未誘導類固醇羥基化，暗示G蛋白β亞基在黃體酮信號傳導中起著重要功能，而外源cAMP能恢復Δfgb1菌株中黃體酮轉化活性的誘導，表明cAMP-PKA途徑介導了尖孢鐮刀菌中的類固醇信號傳導[31]。此外，絲裂原活化蛋白激酶信號通路可調控氨基糖和核苷酸糖代謝、糖胺聚糖降解、碳源和磷酸肌醇代謝通路及戊糖和葡糖醛酸鹽轉換，繼而影響尖孢鐮刀菌香蕉專化型（Fusarium oxysp orum f. sp. cubense，Foc）病原菌的生長發育和致病性[32]。

3 番茄抗枯萎病機制

番茄寄主對枯萎病菌侵染后的反應是全方位、多方面的，表現為初級代謝的改變，啟動和增強抗性相關基因的表達，從而獲得不同程度的免疫性。

3.1 寄主分泌抗真菌化合物

番茄在被病原菌侵染時分泌的抗真菌化合物（即α-番茄堿）能夠與真菌細胞膜形成固醇復合物，導致真菌毛孔和細胞內容物泄漏，從而抵御Fol的入侵[33]；此外，番茄體內的細胞壁結合態酚在受病原物入侵時，通過合成植保素、木質素、類黃酮等物質提高番茄抗病性[34]。另外，番茄毛狀根中的酚類代謝物對于抗枯萎病也至關重要，其可增強番茄植株和根毛部木質素的細胞壁沉積，如4-羥基苯甲酸、香草酸、4-羥基苯甲醛、香草醛和4-香豆酸等[35]。

3.2 激發寄主信號傳導途徑及保衛反應

植物免疫力通常由被認為是免疫激素的物質來定義，如水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）、乙烯（ET）等對病原體的防御反應有不同的調節作用。植物激素在番茄與尖孢鐮刀菌的互作中也起著重要的作用[36]。不能產生ET（ACD過表達）或感知不到這類激素（Nr突變體）的番茄植株，接種Fol后比野生型植株發病癥狀顯著減輕，相反，番茄植株若在積累SA（NahG）的能力上受到損害，則對Fol高度敏感[36]。Fol侵染番茄后，番茄體內水楊酸含量增多，維管褐變和葉片黃化萎蔫的現象顯著減少[37]。JA生物合成中受損的def1突變體番茄植株接種Fol后與對照處理相比，在疾病發展方面沒有差異，暗示JA似乎不參與這種相互作用；此外，Fol對ACD和Nr番茄植株莖的定植程度較低，而對NahG植物的定植范圍比野生型植物更廣[36]。通常，抗病品種形成保衛反應較早且速度較快，在感病品種中只出現部分保衛反應且速度較慢；此外，最新的研究報道番茄內生真菌（Endophyte-Mediated Resistance，EMR）對尖孢鐮刀菌的抗性不依賴于ET、JA和SA，表明這種對枯萎病的誘導抗性反應不同于經典的誘導系統抗性（Induced Systemic Resistance，ISR）反應，為控制番茄枯萎病提供了不依賴于常規防御途徑的可能性[36]。

3.3 寄主抗性基因誘導表達

早在1929年，研究人員從番茄野生型Lycopersicon esculentum Mill.的一個突變體PI79522中發現了一個顯性抗病基因I（Immunity），且抗性是由單個顯性基因決定的，雜交后代的抗性無法降低[37-39]。隨后又發現番茄枯萎病病原真菌分泌的效應子可以觸發寄主ETI（Effector-Triggered Immunity）免疫反應，或抑制寄主抗性基因（Resistant gene, R）的表達。目前，番茄基因組中已有多個R基因被鑒定，應答不同Fol生理小種，分別為I 、I-1、I-2、I-3[38]。Fol侵入番茄后，在番茄木質部中分泌蛋白效應子Avr3 蛋白，誘導宿主的I-3抗性基因大量表達，從而誘導番茄啟動防御機制；同時，AVR1基因編碼的蛋白效應子不僅與I-1基因相對抗，同時也會抑制I-2和I-3介導的免疫反應[40]。Fol侵染番茄時，番茄內源miRNA（如Sly-miR5300和Sly-miR482e-3p）的表達被抑制，其靶向的編碼NBS-LRR類抗病蛋白的R基因表達水平上調，通過負調控的方式參與了番茄抗枯萎病的過程[41-42]；此外，Sly-miR482e-3p還能調控其靶基因SlSGT1 的表達，通過介導乙烯信號傳遞通路以應答病原菌入侵[43]。

4 展望

目前，關于農作物枯萎病的防治方法主要有生物防治、物理防治和化學防治，但這些防治效果較緩慢，易對環境造成污染，且在番茄果實上有殘留，影響人體健康。基于RNA的研究進展發現，RNAi（RNA Interference）是基因轉錄后沉默作用（Post-Transcription Gene Silence, PTGS）的重要機制之一，是近年來重要的生物學發現之一。RNAi主要通過dsRNA特異阻斷體內特定基因表達，由mRNA降解誘使細胞表現出特定基因缺失的表型[44]。在真菌中參與RNAi作用機制的蛋白主要有AGO、DCL和RDR[45]。真菌病害如灰霉菌（B. cinerea）能主動吸收環境中外源sRNA，并靶向調控Bc-DCL1 和Bc-DCL2表達，從而影響病原菌對番茄的侵染過程[46]。由此，科學家提出了噴霧誘導的基因沉默（Spray-Induced Gene Silencing，SIGS）概念，為未來農業生產病蟲害防治提出了全新的方向[47]；此外，研究表明，尖孢鐮刀菌FolRDR1與病原菌致病力密切相關，且FolRDR1與其他尖孢鐮刀菌生理小種，如尖孢鐮刀菌香蕉專化型、尖孢鐮刀菌黃瓜專化型、尖孢鐮刀菌蘿卜專化型等高度保守，可作為開發基于RNAi的新型環境友好型廣譜生物制劑的理想靶標[48-52]。

隨著時代發展，我國農業和生態環保產業逐步實現了協同發展，農作物病蟲害綠色防控理念和技術被廣泛應用于農業植保建設之中，推動了我國社會各產業均衡發展。實施綠色防控是貫徹“公共植保”和“綠色植保”理念的重大舉措，是發展現代農業、建設“資源節約、環境友好”兩型農業的有效途徑。隨著對番茄抗枯萎病研究的不斷深入，借助于現代分子生物學技術與手段，致力于科學地運用RNAi技術生產生物制劑的開發并投入實際應用中，還需要科研人員進一步潛心研究。