MeJA和蔗糖草莓果實采后灰霉病抗性中的作用研究

王媛花

（江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院,江蘇 句容 212400）

目前我國草莓的種植主要以溫室大棚為主，由于種植技術(shù)、環(huán)境條件等因素的限制，導(dǎo)致草莓的病害日趨嚴重[1]，其中，灰霉病是草莓生產(chǎn)中的一種世界性病害，其病原菌為灰葡萄孢菌 (Botrytis cinerea Pers.，B.cinerea)。B.cinerea被認為是非常重要的致病性死體營養(yǎng)型真菌，染色體組分析表明B.cinerea 能分泌大約40種毒素，在采前和采后都會侵染草莓果實，造成果實腐爛，導(dǎo)致果實不能食用[2-4]。草莓一旦感染灰霉病，病果率一般在30%～60%，嚴重的情況下甚至絕收，會給草莓生產(chǎn)造成巨大的損失[5]。

茉莉酸(Jasmonic acid，JA)及其揮發(fā)性甲酯衍生物茉莉酸甲酯(Methyl-jasmonate，MeJA，也稱為甲基茉莉酸)和氨基酸衍生物統(tǒng)稱為茉莉酸類物質(zhì)(Jasmonates，JAs)，也稱為茉莉素、茉莉酮酸和茉莉酮酯，是植物體內(nèi)起整體性調(diào)控作用的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)[6-9]。近年來，有關(guān)茉莉酸和蔗糖處理草莓的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，其不僅對于草莓果實發(fā)育與成熟方面有一定調(diào)控作用，而且以MeJA處理草莓能有效抑制草莓中由灰霉菌引起的灰霉病[10]。蔗糖是調(diào)控植物生長發(fā)育的信號分子，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)蔗糖能夠和茉莉酸共同作用促進草莓果實成熟[11]。但是蔗糖對灰霉病影響的研究還很少，因此本研究就對茉莉酸甲酯與蔗糖對草莓果實灰霉病影響的的分子機理做初步探討，旨在為后續(xù)開展草莓抗病研究工作提供一個研究基礎(chǔ)，也可以為未來草莓的抗病育種工作提供一條新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究試驗于2017年11月—2018年5月，在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院進行。

實驗所用的“紅顏”(Fragaria × ananassa ‘Benihoppe’)草莓果實材料均來自江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學院草莓玻璃溫室。試驗過程中，用來進行果實采后處理的植物生長調(diào)節(jié)劑茉莉酸甲酯和蔗糖購買自來自SIGMA-ALDRICH，吐溫20來自國藥集團化學有限公司。各生長調(diào)節(jié)劑在超凈工作臺上配置成所需濃度，冷藏備用。灰霉菌(Botrytis cinerea Bc)由本校生物工程中心從田間分離所得。病菌培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)。病菌經(jīng)過常規(guī)方法純化以后，接種至PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)14 d。然后在超凈工作臺上將培養(yǎng)基切下放入裝有無菌水的錐形瓶中，振蕩10 h后用4層紗布過濾，顯微鏡鏡檢調(diào)整，制備孢子懸浮濃度為1×105 cfu/mL懸浮液，用于果實病菌處理[12-15]。

1.2 主要試劑配方

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯去皮、去芽眼切成黃豆大小，用略多于所需量的水煮20 min左右，至其軟而不爛，再用4層紗布過濾，然后加入20 g/L瓊脂、20 g/L葡萄糖，定容至1 000 mL，高溫滅菌，備用。茉莉酸甲酯JA：500μmoL/L+0.02% 吐溫-20[16-18]。

蔗糖：15mmol/L+0.02% 吐溫-20[10]。

對照：無菌水+0.02% 吐溫-20。

1.3 試驗方法

1.3.1 MeJA和蔗糖處理采后草莓果實后的發(fā)病規(guī)律觀察

摘取成熟的草莓果實，用配置好的MeJA和蔗糖處理后，直接噴施果面，每24 h噴一次，共3次。第3次噴完待12 h后，用無菌注射器針頭在果實上扎1個小孔，再用配置好的灰霉病懸浮液進行果面噴施。觀察不同處理環(huán)節(jié)中草莓果實的發(fā)病情況。試驗過程要求置于20 ℃恒溫環(huán)境，空氣濕度達到80%以上，光周期16 h/8 h。從果實處理開始每天拍照，直至完全發(fā)病。試驗重復(fù)3次，重復(fù)試驗時，每次處理果實50個。果實處理過程中，統(tǒng)計發(fā)病率和病情指數(shù)。

1.3.2 草莓果實中抗病基因表達量檢測

分別提取不同藥劑處理和發(fā)病情況的草莓果實的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。選取與草莓抗灰霉病相關(guān)的基因16個，轉(zhuǎn)錄據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的基因序列，設(shè)計目的基因熒光定量引物（見表1），并比對驗證，確認無誤后，采用實時熒光定量PCR（qT-PCR）方法，檢測各基因相對表達量。qT-PCR使用儀器為Roche公司的熒光定量LightCycler 96儀，各個基因和內(nèi)參Actin 基因的反應(yīng)總體系為20 μL，其中包含10 μL Til RNase Plus (2x)，1 μL 上下游引物混合液，1 μL cDNA，8 μL無核酸污染的ddH2O，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；PCR定量分析95 ℃變性5 s，60 ℃退火 30 s，40個循環(huán)后，進行溶解曲線分析：95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，最后降溫：50 ℃ 30 s，程序結(jié)束，用Roche的LightCycler 96 SW 1.1軟件分析各功能基因相對表達量。

表1 實時熒光定量 PCR引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法和果實發(fā)病等級劃分

所有基因表達量采用2-ΔΔCT法來計算相對表達量。用植物生長調(diào)節(jié)劑處理的果實內(nèi)各功能基因的表達量均以用水處理果實的相應(yīng)基因表達量為對照。表達量按照上調(diào)下調(diào)倍數(shù)的方式，以不同顏色作為表達量上調(diào)或者下調(diào)的倍數(shù)。

發(fā)病率在灰霉病處理96 h時統(tǒng)計，后發(fā)病率=（發(fā)病的果實/處理果實）×100%。

病果級率=（該病果級的病果數(shù)/所有發(fā)病的果實）100%。

病果級按照圖1中的標準來劃分：

圖1 草莓果實發(fā)病等級劃分標準

2 結(jié)果與分析

2.1 MeJA和蔗糖處理草莓果實后的發(fā)病規(guī)律分析

從試驗結(jié)果（見圖1）可以看出，用MeJA和蔗糖處理后的草莓果實與對照相比，灰霉病開始發(fā)病時間都差不多，都在接種灰霉病73 h開始發(fā)病。但是用MeJA和蔗糖處理后發(fā)病的程度與對照相比要輕很多。處理96 h后，對照大部分果實發(fā)病已經(jīng)很嚴重了，而用MeJA和蔗糖處理的果實發(fā)病癥狀依然很輕。從表2的發(fā)病率統(tǒng)計和發(fā)病程度的統(tǒng)計上來看，MeJA和蔗糖處理的果實發(fā)病程度顯著更輕于對照。從這個結(jié)果能夠推斷出，MeJA和蔗糖對于采后草莓灰霉病的發(fā)生中是有一定作用的。

表2 對照和處理草莓果實接種灰霉病后發(fā)病情況

2.2 草莓果實中相關(guān)抗病基因的表達量分析

從圖3的試驗結(jié)果可以看出，與抗病相關(guān)的基因，在MeJA和蔗糖處理后與對照相比都受到不同程度的調(diào)控。而蔗糖處理后這些基因的調(diào)控更為明顯。在被MeJA處理的果實中，除MYB10、WRKY70基因外，所有與MeJA合成有關(guān)的基因均為負調(diào)控，而WRKY1基因的變化倍數(shù)達到了2～5倍，MYB10基因的變化倍數(shù)則達到了10倍以上，結(jié)合前面發(fā)病率數(shù)據(jù)，可以推測其對于灰霉病有不小的抗性。而在蔗糖處理果實中，除ERF3、MYB44.3、PR4、WRKY25及WRKY33基因外，皆為正調(diào)控，其中，AMY3基因的變化量達到2～5倍，bHLH3基因為5～10倍，而MYB10、WRKY1更是在10倍以上，結(jié)合前面發(fā)病率數(shù)據(jù)，也能推測這四個基因的過量表達也許能減輕灰霉病病果的發(fā)病程度，并且MYB10和WRKY1這兩個基因在兩種藥劑處理中都表現(xiàn)為2倍以上的正調(diào)控，在后續(xù)研究中需重點關(guān)注。

圖2 草莓果實處理后接種灰霉病發(fā)病進程觀察

圖3 抗病基因表達量分析

3 討論

茉莉酸類化合物在植物抗逆基因中起著重要的作用。草莓作為重要的園藝作物，對其各功能基因在抗灰霉病方面的影響分子機理研究，能夠為草莓抗逆改良提供理論依[19-21]。目前已經(jīng)從草莓中分離鑒定出各種功能基因，并對其基因組分布、分子特征、系統(tǒng)進化等方面進行了分析。草莓灰霉病作為灰霉病是較為普遍且嚴重的病害之一，而且果實和葉片中都能感病，因此給草莓產(chǎn)量造成了很大的損失[2-3]。目前，普遍而有效的防治灰霉病的方法是化學藥劑防治，化學藥劑會使灰霉病產(chǎn)生抗藥性[16]。要從根源上解決，只有培育抗病品種才能最大限度地降低其危害，而分子育種是最為直接有效的方法，所以應(yīng)該尋找各種有效的抗病基因為后續(xù)的育種工作提供素材，并進一步篩選出更好的目標基因，逐步提高良種素質(zhì)。

本試驗用茉莉酸甲酯和蔗糖處理采后草莓果實，對草莓發(fā)病規(guī)律做了相關(guān)研究，同時用實時熒光定量技術(shù)從抗病基因的表達量變化方面研究分析了其對于灰霉病的影響。研究結(jié)果表明，MeJA和蔗糖處理均對果實灰霉病的抑制有正向作用。期間發(fā)現(xiàn)了一些抗病相關(guān)基因（比如MYB10和WRKY1等）在處理后調(diào)控倍數(shù)明顯，因此可以推斷這些基因在灰霉病的抗性方面有關(guān)鍵作用，有可能在草莓中起到抗灰霉病的作用。本研究對深入解析草莓抗病的分子機理具有參考價值，同時為抗病育種研究提供了一條新的方向和思路。