納米纖維素載體的超聲輔助酶解法制備及表征

高驍雋， 李 燦

(延邊大學附屬醫院 腎病科， 吉林 延吉 133000)

纖維素是一種豐富的可再生資源[1]， 具有來源廣泛、成本低等優點. 微晶纖維素(MCC)是重要的纖維素類型， 可用于醫藥等領域[2]. 但傳統方法制得的MCC粒徑大， 在溶液中分散不均勻， 這些缺點限制了其應用. 納米載體的粒徑較小， 其寬度約為5～70 nm， 長度為100 nm至幾微米[3]. 通常， 納米載體具有比表面積大、強度高、粒徑小、細胞毒性低、生物相容性好和可生物降解等特性， 且不會引發免疫系統反應[4-5]. 近年來， 納米晶體纖維素(NCC)作為納米載體受到人們廣泛關注. 多種官能團和生物活性分子可共價或非共價結合到NCC表面; NCC不能被腎臟清除， 具有良好的體內穩定性[6]， 而巨噬細胞易將其從血流中轉移到細胞中， 從而增強NCC的性能[7]. 因此， NCC在生物醫學等領域應用廣泛， 如生產屏障膜、抗菌膜、藥物遞送材料、組織工程和血管移植材料等[8-10].

目前多采用物理和化學方法制備NCC， 如蒸汽爆炸處理[11]、高壓均質化[12]和酸/堿水解[13]等. 但傳統的物理、化學制備方法有耗能大、易導致環境污染等缺點. 酶催化具有無污染、效率高和能耗低等優點[14]; 超聲波具有均質化和加熱效應， 還可增加酶與底物的接觸面積， 加速酶與底物之間的反應[15-16]. 因此， 本文以MCC為原料， 采用超聲輔助酶解法制備NCC， 并通過掃描電子顯微鏡(SEM)、粒度分析、Fourier變換紅外光譜(FT-IR)和熱重分析(TGA)對NCC進行表征和性質分析.

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

MCC購自國藥集團化學試劑有限公司; 纖維素酶購自諾維信(中國)生物技術有限公司； 所有實驗均使用去離子水； 其他化學品均為分析純試劑.

S-3700N型掃描電子顯微鏡(上海日立高新技術集團); Zetasizer Nano ZS90型納米粒度電位儀(英國馬爾文儀器公司); IRPrestige-21型Fourier變換紅外光譜(日本島津公司); Q500TGA/DSC 1型熱重分析儀(美國TA公司); Scientz-IID型超聲破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司); TGL-16型離心機(長沙盈泰儀器有限公司).

1.2 方 法

1.2.1 制備NCC

取5個250 mL錐形瓶， 先向每個錐形瓶中準確添加6 g MCC和200 mL 1 mol/L的Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.0)， 再添加終濃度分別為20,40,80,120,160 U/g的纖維素酶, 其中U定義為在50 ℃、pH=4.8條件下， 用纖維素酶水解濾紙1 min釋放1 μg葡萄糖所需的酶量. 在恒溫振蕩水浴鍋中， 于50 ℃水解12 h， 每隔2 h取樣， 沸水浴5 min終止酶反應. 利用葡萄試劑盒法測定產生的葡萄糖量.

將所得反應液在超聲破碎儀中以300 W的恒定功率處理1 h. 用離心機將混合物以3 000 r/min離心10 min， 以去除大于1 μm的顆粒. 將懸浮液以13 000 r/min離心10 min. 用去離子水洗滌沉淀， 沉淀物凍干保存.

1.2.2 SEM分析

用掃描電子顯微鏡觀察， 樣品進行噴金處理， 設置探針電流為 50 pA， 燈絲電流為2.7 A， 加速電壓為10 kV， 工作距離為10 mm.

1.2.3 粒度分析

用納米粒度電位儀分析樣品的粒度分布. 取1.5 mL超聲后的懸浮液， 沿比色皿壁緩慢加入， 防止產生氣泡， 用聚苯乙烯測量池測量并進行分析， 以確定樣品粒度分布和平均粒度.

1.2.4 FT-IR分析

將每個樣品與溴化鉀以質量比 1∶100 混勻后， 在瑪瑙研缽中研磨至約 300目粉末， 于壓片機上制成透明薄片. 用光譜儀在4 000～500 cm-1的波數范圍內以4 cm-1光譜分辨率收集樣品的FT-IR光譜， 在室溫下進行64次掃描.

1.2.5 TGA分析

用熱重分析儀測定樣品的熱穩定性. 以40 mL/min的恒定氮氣流量進行分析， 確保質量變化歸因于熱降解. 樣品以20 ℃/min升溫， 在40～500 ℃測量隨溫度升高樣品的質量損失或放出的熱量.

2 結果與討論

2.1 利用纖維素酶水解MCC

圖1為纖維素酶濃度對葡萄糖產量的影響. 由圖1可見， 用不同濃度纖維素酶水解MCC， 葡萄糖的釋放量隨時間延長而增加. 在20，40，80，120 U/g纖維素酶濃度下， 葡萄糖釋放量增長較緩慢， 而在160 U/g纖維素酶作用下， 葡萄糖質量濃度增加較快， 在12 h時達到最大值， 為18.83 g/L. 通過纖維素酶的催化作用， 微晶纖維素被降解， 釋放出葡萄糖， 同時微晶纖維素的大小及結構發生變化.

圖1 纖維素酶濃度對葡萄糖產量的影響Fig.1 Effect of cellulase concentration on glucose yield

2.2 SEM結果

樣品MCC和NCC的SEM照片如圖2所示. 由圖2(A)可見， 未經處理的MCC呈長桿狀， 表面形態粗糙， 長度為幾十到幾百微米. 通常， MCC由數百個單獨的小纖維素晶體以氫鍵連接構成[17]， MCC表面粗糙， 可被纖維素酶水解生成納米纖維素晶體[18]. 由圖2(B)可見， MCC經超聲輔助酶解處理后， 長桿狀的MCC片段化， 形成粒狀的NCC.

2.3 粒度分析結果

樣品MCC和NCC的粒度分析結果如圖3所示. 由圖3可見， MCC樣品的長度為2.67～5.56 μm， 平均長度為3.88 μm. NCC樣品粒徑和平均粒徑顯著降低， 直徑為10.10～18.17 nm， 長度為531.20～1 106.00 nm. 結果表明， 經超聲輔助酶解后， MCC的粒徑減少， 形成了納米級粒徑的NCC[19].

圖2 樣品MCC(A)和NCC(B)的SEM照片Fig.2 SEM images of MCC sample (A) and NCC sample (B)

2.4 FT-IR分析結果

通過FT-IR研究超聲輔助酶水解MCC生成NCC的化學結構變化, 結果如圖4所示. 由圖4可見， 3 400～3 100 cm-1間的峰值強度與—OH基團的拉伸振動有關[20]. 與MCC相比， NCC在該處的峰強度降低， 表明NCC分子間氫鍵被破壞. 1 621 cm-1附近的特征峰與水分子有關， 與MCC相比， NCC在該處的峰強度降低， 表明NCC吸收水分子的能力減弱[21]. 結果表明， MCC分子內、分子間氫鍵被破壞， 微晶纖維素被有效降解成NCC.

圖3 樣品MCC和NCC的粒度分布Fig.3 Particle size distribution of MCC and NCC samples

圖4 樣品MCC和NCC的FT-IR光譜Fig.4 FT-IR spectra of MCC and NCC samples

2.5 TGA分析結果

圖5(A)和(B)分別為樣品MCC和NCC的TGA和微商熱重(DTG)曲線. 由圖5可見， 樣品的熱譜存在3個階段. 第一階段在低溫(<150 ℃)范圍內， 由于水分或低分子量化合物的蒸發， 因此樣品MCC和NCC的質量減小， 損失不超過總質量的3%. 第二階段對應纖維素降解過程， 樣品MCC在320～400 ℃內質量大幅度下降， 發生最大質量下降時的溫度為370 ℃; 樣品NCC分解起始溫度為170 ℃， 最大分解速率的溫度為380 ℃， 在410 ℃分解完成. 與MCC相比， NCC的熱穩定性降低[22]， 這是因為超聲輔助的纖維素酶水解使NCC的分子量降低， 比表面積增加， 暴露出更多的活性基團， 導致熱穩定性降低[23]. 與硫酸水解法[24]相比， 本文獲得的NCC樣品具有更好的熱穩定性. 在第三階段， 焦化殘渣氧化和分解， 形成低分子量的氣態產物. 樣品MCC和NCC的殘炭量分別為8.67%和28.16%.

圖5 樣品MCC和NCC的TGA曲線(A)和DTG曲線(B)Fig.5 TGA curves (A) and DTG curves (B) of MCC and NCC samples

綜上所述， 本文以MCC為原料， 采用超聲輔助酶解法制備了納米纖維素載體(NCC)， 遠小于MCC的顆粒尺寸， 其直徑為10.10～18.17 nm， 長度為531.20～1 106.00 nm. 與MCC相比， NCC中纖維素結構變化主要為氫鍵減少. 超聲輔助酶解法制備NCC的過程具有綠色、溫和、高效等優點， 且制備NCC的穩定性較好， 因此該方法在生物醫學等領域應用前景廣闊.