仿生靜電紡水凝膠纖維束支架在脊髓損傷修復中的效果研究

鐘 磊，許 猛（通訊作者）

（吉大二院關節外科 吉林 長春 130000）

脊髓損傷是臨床常見的病癥，表現為患處以下肢體功能障礙，給患者造成身體、心理嚴重影響。目前，臨床治療方法主要有手術、細胞生物工程等方法，但均有一定局限性[1]。近年來，隨著現代組織工程技術發展，生物組織工程植入逐步成為脊髓損傷治療新方向。生物組織支架植入能夠發揮橋接損傷部位、抑制和阻斷膠質疤痕生成，以及為損傷處到遠端軸突的組織再生提供重要的引導作用。水凝膠是組織工程中常用的材料，有著良好生物學特性[2]。靜電紡絲是一種新型纖維制備技術，應用該技術能制出定向性纖維，實現良好的仿生效用。通過動物模型實驗對基于靜電紡絲的天然水凝膠纖維束支架在脊髓損傷修復治療中的效果，現報道如下。

1.資料與方法

1.1 一般資料

2020 年1 月—2021 年1 月開展構建脊髓損傷動物模型研究，實驗動物：40 只大鼠均為雄性，體重200 ～250 g，平均（210.5±16.8）g。由吉林大學實驗動物中心提供。置于恒溫23 ～25 ℃，濕度45%～60%，光照12 h/d 的室內飼養。日常飲食滅菌處理，方案一致。飼養2 周后隨機分成試驗組和對照組，均為20 只。

實驗器材：電子顯微鏡、光學顯微鏡、手術刀片、線剪、血管鉗、縫合三角針、咬骨鉗等器械。

1.2 方法

（1）支架制作：試驗組大鼠采用仿生靜電紡水凝膠纖維束支架：將500 mg 的GelMA 加入到5 mL HFIP 中制備成靜電紡絲溶液，避光下將0.5 g 的2-羥基-4'-（2-羥乙氧基）-2-甲基苯丙酮溶解至10 mL 無水酒精成光交聯液，然后裝至5 mL 注射器內，再通電處理，于距注射器嘴20 cm 處置平行電極，間距30 mm，于電極桿間產生平行的定向纖維膜，收集，疊加成纖維膜，再卷成圓柱纖維束，然后置于光交聯液內用紫外線照射1 h 后交聯，用PBS 浸泡沖洗數次，去除多余光交聯液，備用。對照組大鼠采用常規明膠水凝膠纖維束支架：將500 mg的Gelatin 溶于5 mL 的HFIP 中形成Gelatin 溶液，裝于5 mL 注射器內置于微量注射泵上，通電，在距注射器嘴20 cm 處置平行電極，間距30 mm，通電后形成平行定向纖維膜，收集，疊加成纖維膜，卷成圓柱纖維束，再置于2%戊二醛+乙醇溶液內24 h 交聯，用PBS 浸泡沖洗數次，去除多余光交聯液，備用。（2）模型構建及支架置入：對大鼠麻醉，以T9 為中心做一道3 cm 左右縱切口，分開椎旁的肌肉，再開椎管，使T8 ～10 脊髓暴露，對右側脊髓半切成3 mm 長缺損，模型建立完成。然后用0.9%氯化鈉溶液沖洗，在缺損處分別置入修剪合適的纖維束支架，試驗組和對照分別用制備好的纖維束支架，完成后逐層縫合。術后肌內注射抗生素3 d。

1.3 觀察指標

（1）運動功能評估：在術后1、4、8、12 周應用BBB 量表評測大鼠模型下肢運動功能，將模型大鼠放到相對空曠的區域讓其自由行動5 min，每只均由2 名不知分組的研究人員一一評價，取平均值。（2）脊髓組織細胞學：兩組大鼠均在術后第12 周麻醉處死，取出術中脊髓包埋處理，進行染色處理，應用專業軟件定量測定星形膠質細胞、血管內皮細胞的染色情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 22.0 統計分析軟件，計量資料以均數±標準差（± s）表示，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以頻數表示。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2.結果

2.1 兩組模型大鼠術后運動功能恢復對比

在術后測定，術后1 周兩組大鼠比較差異無統計學意義（P＞0.05）；術后4、8、12 周時試驗組大鼠BBB 評分均顯著高于對照，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組模型大鼠術后不同節點運動功能評分比較（ ± s，分）

表1 兩組模型大鼠術后不同節點運動功能評分比較（ ± s，分）

組別 只數 術后1 周 術后4 周 術后8 周 術后12 周試驗組 20 1.78±0.37 5.03±1.06 8.56±1.77 11.42±1.47對照組 20 1.83±0.45 4.45±1.13 6.07±1.14 8.31±1.22 t 0.922 4.584 5.092 10.283 P 0.076 0.001 0.000 0.000

2.2 兩組模型大鼠術后脊髓組織細胞學對比

在術后12 周測定，試驗組模型大鼠的脊髓中神經干細胞、血管內皮細胞的染色光密度均顯著高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 兩組模型大鼠術后脊髓組織細胞學染色熒光強度比較（ ± s）

表2 兩組模型大鼠術后脊髓組織細胞學染色熒光強度比較（ ± s）

組別 只數 神經元干細胞 血管內皮細胞試驗組 20 530±115 1 510±210對照組 20 285±16 635±177 t 15.404 17.182 P 0.000 0.001

3.討論

當前，脊髓損傷修復治療仍是臨床很大挑戰，原因在于人類中樞神經系統再生能力弱，尤其是嚴重挫傷與橫向損傷時，預后較差，嚴重影響患者生活質量，也給患者家庭和社會帶來很重負擔。近年來，雖有諸多研究取得較好成果，但對急慢性脊髓損傷的針對有效的治療措施不多。一直以來，支架材料是生物組織工程一個科研焦點。諸多研究表明生物支架在中樞神經系統修復治療中具有遞送細胞和藥物功能，可實現良好修復效果。但從臨床研究和實踐看，當前尚無強度佳、生物相容性良好的支架。盡管膠原蛋白已成為具有良好相容性有前景的生物材料，但其低機械性能限制其應用。

靜電紡絲支架就是利用靜電紡絲技術將含有高分子聚合物溶液制成懸浮的小液滴，再通過高壓電場將由小液滴形成射流吸附在接收板上，接收板上射流經自然冷卻至溶劑揮發后形成紡絲纖維束，將紡絲纖維束多層疊加后形成靜電紡絲支架。制得的紡絲相互交叉，同時在纖維間留有一定空隙，使其有較高的比表面積[3]。靜電紡絲支架所形成高比表面積和孔隙結構與體內的細胞外基質有著相似的結構，有利于細胞在支架上黏附和生長。國外研究發現細胞可以沿靜電紡絲纖維方向定向生長，該特性在組織生物工程應用中有著積極意義?；诖?，提出應用天然水凝膠通過靜電紡絲技術制成生物支架，結果顯示，試驗組大鼠術后4 個月開始BBB 評分高于對照組，表明仿生靜電紡水凝膠纖維束支架能更好促進損傷脊髓功能恢復，且隨著時間延長，康復效果越好。同時，在術后12 周時，試驗組的分數為對照組1.5 倍左右。另外，在術后12 周進行測定，試驗組模型大鼠脊髓中神經干細胞、血管內皮細胞的染色光密度均高于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）。由此說明，在仿生靜電紡水凝膠纖維束支架中，神經元相對更多，且星形膠質細胞較多。

BBB 評分是用于評測脊髓運動功能恢復的重要、敏感性工具。諸多研究已證實椎管附近的NSC 具有多項分化潛能[4-5]。該類細胞可因損傷誘導增殖并分化成星形膠質細胞、神經元等。因而，該類干細胞可用于脊髓損傷內源性修復細胞來源。仿生靜電紡水凝膠纖維束支架因其在促進組織血管化方面有獨特優勢。相比物理擴散，血管能夠更好地為組織提供必要的營養物質，并能有效去除代謝性物質。從術后標記血管內皮細胞熒光強度看，試驗組大鼠的血管再生整體更優。

綜上所述，仿生靜電紡水凝膠纖維束構建的生物支架在脊髓損傷修復治療中有顯著效果，優于常規明膠生物支架，能夠更好促進神經干細胞迀移，誘導分化神經元，且促進血管生成，有著重要價值。