異鼠李素對神經膠質瘤細胞C6的抑制作用及機制研究

摘要：目的?探究小分子化合物異鼠李素對神經膠質瘤的抑制作用。方法?選擇神經膠質瘤細胞C6細胞株為實驗模型，通過噻唑藍（MTT）比色法實驗檢測0、1、5、10、25、50μM的異鼠李素對C6細胞增殖的抑制作用，利用平板克隆實驗驗證異鼠李素可以抑制C6細胞的克隆形成能力，并通過免疫蛋白印跡（Western?blot）法檢測不同濃度的異鼠李素對細胞蛋白表達水平影響。結果?異鼠李素明顯抑制C6細胞的增殖、克隆形成能力。并且，異鼠李素能夠下調CDK2的蛋白表達。結論?異鼠李素可能靶向CDK2，并通過下調CDK2的表達從而抑制C6細胞的生長。

關鍵詞：大鼠;神經膠質瘤;異鼠李素;C6;CDK2

腫瘤是在許多致癌因素的作用下，引起局部組織增生而形成的贅生物，并可以通過血液、淋巴液進行遠處轉移至全身不同臟器，是目前威脅人類健康最重要的疾病之一。據統計世界上每年都有超過?1400?萬的人患上腫瘤[1]，并在?2015?年之后腫瘤在全球死亡病因中列居第二[2]。飲食、慢性炎癥、吸煙、輻射、大氣環境污染等都可以促進腫瘤的發生。

在惡性腫瘤中，神經膠質瘤是一種中樞神經系統最常見的惡性腫瘤，約占顱內惡性腫瘤的50%。神經膠質瘤好發于成人，腫瘤細胞呈彌漫性生長，腫瘤邊界不清、惡性程度高等特點導致神經膠質瘤患者五年生存率低于10%，嚴重危害人類健康[3]。

1?方法

1.1?MTT法檢測異鼠李素對C6細胞增殖的抑制作用

收集細胞并合理調整細胞濃度，5%?CO2，37?℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底，加不同濃度梯度的異鼠李素后每孔加入20?μL?MTT溶液。4h后終止培養，每孔加入150?μL二甲基亞砜，在酶聯免疫檢測儀OD490?nm處測量各孔的吸光值。后將數據整理利用Graphpad?prism軟件進行作圖分析。

1.2?平板克隆實驗檢驗異鼠李素對C6細胞克隆形成的抑制作用

每孔2000個對數生長期的C6細胞接種于六孔板中，隔天給藥后置于CO2培養箱中培養7天左右。當培養皿中出現肉眼可見的克隆時，終止培養，用PBS清洗細胞2次。加4%多聚甲醛固定液5?mL固定細胞15分鐘。然后去固定液，加適量結晶紫染色液染10～30分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。用肉眼直接計數克隆，最后計算克隆形成率，Image?J軟件計數并作圖分析，克隆形成率（對照組）=實驗組克隆數/對照組克隆數*100%，后將數據整理利用Graphpad?prism軟件進行作圖分析。

1.3?Western?blot檢測異鼠李素作用后CDK2的表達水平

異鼠李素處理C6細胞后，對細胞裂解提取總蛋白。方法為，去除培養基，用PBS涮洗，每皿加入50?μL細胞裂解液，并使培養皿傾斜放入冰中10?min使細胞裂解充分，將細胞裂解液轉移至滅菌1.5?mL?EP管中，使用冷凍高速離心機在4?°C的條件下進行離心后將沉淀棄掉，上清液即為細胞總蛋白。隨之利用BCA法測蛋白濃度。一抗4?°C過夜，二抗常溫孵育1?h，自動發光凝膠成像系統讀取結果，分析結果。

1.4?統計學分析

本研究采用Graphpad?prism軟件進行數據處理并繪圖，P<0.05可說明結果具有統計學差異。

2?結果

與對照組相比（圖1），異鼠李素能夠明顯抑制C6神經膠質瘤細胞的增殖能力。并且，隨著異鼠李素濃度的升高，C6細胞的增殖活力明顯下降，在濃度為25?μM時，細胞存活率僅為45%。當濃度達到最大給藥濃度50?μM時，細胞存活率下降了65%左右，這說明異鼠李素對C6腫瘤細胞具有明顯的殺傷效果。

細胞傷口愈合實驗所示（圖2、3），和對照組相比，在相同給藥時間下，C6細胞的遷移能力隨著藥物濃度的增高呈下降趨勢。異鼠李素可以有效抑制C6神經膠質瘤細胞的遷移、克隆形成能力。

實驗發現CDK2蛋白隨著異鼠李素濃度的增高而下降（圖4）。對western?blot條帶結果所進行灰度值統計分析發現（圖5），藥物濃度為10?μM時，CDK2的蛋白已下降50%以上。因此，異鼠李素可下調C6細胞CDK2蛋白的表達。

3?討論

C6是一株來源于大鼠的神經膠質瘤細胞。CDK2蛋白的異常高表達與腫瘤細胞的發生發展密切相關，尤其該蛋白在細胞周期信號通路中發揮著舉足輕重的作用。本文研究顯示，異鼠李素能夠顯著降低CDK2蛋白表達水平，并且對C6神經膠質瘤細胞的增殖、遷移有抑制作用，因此可推測，異鼠李素可能通過降低CDK2蛋白的表達，影響了腫瘤細胞細胞周期通過，最終抑制神經膠質瘤生長。然而這些具體作用機制需要進一步深入研究。

相信通過科研的不斷深入，進一步了解小分子藥物異鼠李素的抗癌機制，相信在不久將來對神經膠質瘤分子靶向治療領域將會有一個質的飛躍，造福全人類。

參考文獻：

[1]RUSSO?M，RUSSO?G?L，DAGLIA?M，et?al.Understanding?genistein?in?cancer：the“good”and?the“bad”effects：a?review[J].Food?Chemistry，2016，196：589-600.

[2]WE?Library.National?bureau?of?statistics?of?China.China?statistical?yearbook[M].Beijing：China?Statistics?Press，2010.

[3]AQUILANTI?E，MILLER?J，SANTAGATA?S，et?al.Updates?in?prognostic?markers?for?gliomas[J].Neuro-oncology，2018，20：17-26.

作者簡介：馬徐民，1993年10月生，男，漢族，湖北襄陽，助教，碩士研究生，小分子化合物抗腫瘤細胞的機制研究。