基于近紅外光譜法建立的模型快速預測苗藥水冬瓜葉中金絲桃苷和異槲皮苷

韓忠耀,文朝旭,李 燕,蒙慧彤,鄧先擴,胡志平,盧 洋,田 浩,王萬樂

(1.黔南民族醫學高等專科學校 藥學系,都勻 558000;2.遵義醫科大學 檢驗醫學院,遵義 563006)

水冬瓜葉為山茱萸科植物有齒鞘柄木[Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia(Harms)Hu]的干燥葉[1],具有較高的藥用價值[2-3],為貴州省少數民族用藥。水冬瓜葉主要含有紫丁香苷、金絲桃苷、異槲皮苷、熊果酸、7-羥基-6-甲氧基香豆素等化學成分[4-9],具有抗炎鎮痛[10-11]、免疫調節[12-13]等生物活性。其中,金絲桃苷、異槲皮苷等為水冬瓜葉中主要指標性的化學成分,對評價苗藥水冬瓜葉品質具有重要參考價值。

金絲桃苷和異槲皮苷的測定方法主要為高效液相色譜法,該方法檢測較耗時、費力。因此,建立快速檢測水冬瓜葉中金絲桃苷和異槲皮苷含量的方法意義重大。近紅外光譜法(NIR)是近年來發展迅速、應用較為廣泛的一種檢測新技術,該方法具有分析快速、操作簡便、無損、綠色等特點,被廣泛應用于食品[14-15]、林產工業[16-18]、煙草[19-20]、醫藥[21-23]等領域。NIR 不僅可用于離線建模以實現快速檢測,還可在醫藥、食品、煙草等工業領域實現在線實時動態快速監測,有利于產品質量的快速評價。

目前水冬瓜葉的相關研究主要集中在質量控制[4]、生藥學鑒定及真偽鑒別[16]等方面,采用NIR研究水冬瓜葉的報道較少,尚未發現其在測定水冬瓜葉中金絲桃苷和異槲皮苷含量方面的應用。因此,本工作采用NIR 建立了穩定性高、預測精度較高的苗藥水冬瓜葉中金絲桃苷和異槲皮苷含量快速分析模型,并應用于實際樣品中金絲桃苷和異槲皮苷含量的預測,以期為貴州特色民族藥水冬瓜葉的質量控制及快速檢測提供方法參考,也為該藥材品質的快速評價提供新思路。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Luminar 5030型聲光可調濾光器近紅外光譜儀,主要部件包括光學部分、控制部分、電源適配器,軟件包括SNAP 光譜處理軟件;The Unscrambler化學計量學分析軟件;Agilent 1260型高效液相色譜(HPLC)儀,配二極管陣列檢測器;PX125DZH 型電子天平;KQ3200型超聲儀;WK-1000A 型高速粉碎機。

混合對照品溶液:分別取適量金絲桃苷、異槲皮苷對照品,用甲醇溶解并定容至50 mL,配制成金絲桃苷、異槲皮苷質量濃度分別為0.041 0,0.052 0 g·L－1的混合對照品溶液。

金絲桃苷對照品批號為111521-201809,純度為94.9%;異槲皮苷對照品批號為CHB180628,純度不小于98%。

乙腈為色譜純;其他所用試劑均為分析純;試驗用水為娃哈哈純凈水。

水冬瓜葉藥材(S1～S106),均采自于貴州省都勻市經濟開發區大坪鎮,經度為107°38′33″E,緯度為26°13′46″N,海拔為675 m,其中S1～S90為校正集樣品,S91～S106為驗證集樣品。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 NIR 條件

開機預熱時間0.5 h;掃描次數300次;波長范圍1 100～2 300 nm;波長增量2 nm;測量方式為透射;增益調節×1;樣品類型為int.Ref.;數據格式為透過率;掃描方式為比率模式。

1.2.2 HPLC條件

Agela Promosil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm);柱溫35℃;流動相A 為0.2%(體積分數)磷酸溶液,B為乙腈;流量1.0 mL·min－1。梯度洗脫程序:0～10.0 min時,A 由87%降至81%;10.0～20.0 min時,A 由81%降至55%;20.0～22.0 min時,A 由55%降 至30%,保 持3.0 min;25.0～25.1 min時,A 由30%跳轉至87%;25.1～30.0 min時,A 為87%。

1.3 試驗方法

將水冬瓜葉粉碎后過4 號篩(250 μm±9.9μm),取約1.0 g樣品于具塞錐形瓶中,加甲醇100 mL,稱取質量。在90 ℃水浴中回流提取1 h,冷卻后再次稱取質量,并用甲醇補足減失量。過濾,濾液按照NIR 儀器工作條件測定。另取適量濾液過0.45μm 濾膜,濾液按HPLC 儀器工作條件測定,所得測定值即為參考值。

1.4 建模和模型評價

將1.3 節得到的金絲桃苷和異槲皮苷的NIR原始光譜圖分別用SNAP 光譜處理軟件中的S-G first derivative(一階微分法)和SNV-Smoothing(標準正態變量交換法-平滑法)進行預處理。用偏最小二乘法(PLS)在1 100～2 300 nm 和1 100～1 400 nm 波段內建模,并采用三維空間分布值(Influence)和線性相關性(Correlation)統計量對照檢驗,剔除模型中的異常值(Outlier)。所建模型性能用相關系數(R)、校正均方根誤差(RMSEC)、預測均方根誤差(RMSEP)、預測相對偏差(RSEP)評價。

2 結果與討論

2.1 預處理方法的選擇

受光的散射、雜散光及儀器響應等影響,原始光譜中冗余信息和噪聲信號干擾較大,在定量分析前,需要選擇合適的方法對原始光譜進行預處理。以苗藥水冬瓜葉中金絲桃苷和異槲皮苷含量為待測對象,試驗考察了預處理方法分別為SNV(標準正態變量交換法)、SNV-Smoothing、Add constant(加常法)、Add constant-Smoothing(加常-平滑法)、S-G first derivative時對所建模型性能的影響,結果見表1。

表1 預處理前后模型評價結果Tab.1 Evaluation results for model before and after pretreatment

表1(續)

由表1可知:原始光譜圖經預處理后,R增大,RMSEC、RMSEP、RSEP均減小,模型性能變好;當預處理方法分別為SNV-Smoothing 和S-G first derivative時,金絲桃苷模型的R較高,RMSEC、RMSEP、RSEP較小或與其他方法的接近。綜合考慮,試驗分別采用SNV-Smoothing 和S-G first derivative對金絲桃苷和異槲皮苷的原始光譜圖進行預處理。

2.2 建模波段的選擇

為進一步降低冗余信息及噪聲干擾,克服近紅外光譜吸收帶重疊造成的影響,并提取有效信息,需要對建模波段進行篩選。試驗比較了以不同波段建模時模型的性能,所得RMSEC、RMSEP、RSEP 等結果見表2。

表2 以不同波段建模時模型的評價結果Tab.2 Evaluation results for models when modeling in different wavelength zones

由表2可知:金絲桃苷模型在1 100～2 300 nm波段、異槲皮苷模型在1 100～1 400 nm 波段時,所得R較高,RMSEC、RMSEP 和RSEP 較小 或和其他波段的接近。綜合考慮,試驗分別選擇在1 100～2 300 nm 和1 100～1 400 nm 波段建立金絲桃苷和異槲皮苷模型。

2.3 模型的建立和評價

在優化的試驗條件下,以校正集樣品的紅外光譜數據和參考值建立金絲桃苷和異槲皮苷的模型,結果顯示:金絲桃苷模型的R為0.913 6,RMSEC為0.241 4,RMSEP為0.270 5,RSEP為0.177 5;異槲皮苷模型的R為0.907 7,RMSEC 為0.079 1,RMSEP為0.020 8,RSEP為0.033 9。

為評價建模效果,按照試驗方法分析16批驗證集樣品,所得NIR 原始光譜圖經預處理分別導入金絲桃苷、異槲皮苷模型以對金絲桃苷和異槲皮苷含量進行預測,所得結果見表3。

由表3可知:金絲桃苷和異槲皮苷的預測值與參考值的相對誤差分別為－2.8%～2.9%、－5.1%～5.9%,表明所建模型預測效果較好。

表3 金絲桃苷和異槲皮苷預測結果Tab.3 Prediction results of hyperin and isoquercitrin

采用The Unscrambler化學計量學分析軟件分別繪制金絲桃苷和異槲皮苷的參考值與預測值的相關圖,結果見圖1。

由圖1可知,2種目標物預測值和參考值基本一致,相關系數大于0.988 0。

圖1 金絲桃苷和異槲皮苷預測值與參考值的相關圖Fig.1 Correlation diagrams between predicted values and reference values of hyperin and isoquercitrin

2.4 精密度試驗

按照試驗方法重復分析S1樣品6次,所得光譜圖經預處理后代入2種目標物的NIR模型,計算金絲桃苷和異槲皮苷預測值的相對標準偏差(RSD),結果分別為2.7%,3.3%,表明方法精密度較好。

2.5 穩定性試驗

按照試驗方法處理S1 樣品,所得濾液分別放置0,1,2,3,6,12 h,再用近紅外光譜儀分析,所得光譜圖經預處理后代入金絲桃苷和異槲皮苷NIR模型,計算金絲桃苷和異槲皮苷預測值的RSD,結果分別為2.9%,3.4%,表明水冬瓜葉藥材樣品在12 h內穩定性良好。

本工作基于金絲桃苷和異槲皮苷的NIR 光譜圖建立的模型來預測水冬瓜葉中這兩種物質的含量,實現了對苗藥水冬瓜葉藥材的快速質量評價,可為苗藥水冬瓜葉藥材中金絲桃苷和異槲皮苷快速定量分析提供新方法與新思路。