高效液相色譜法測定祛斑美白類化妝品中4種具有美白功效的物質

李 莉,李 碩,王海燕,孫 磊

(中國食品藥品檢定研究院,北京 100050)

熊果苷能夠抑制酪氨酸酶[1-3],阻止黑色素形成,是祛斑美白類化妝品中使用頻次較高的功效原料[1]。按照結構不同,可將熊果苷分為α-熊果苷和β-熊果苷,兩者為差向異構體[4-5]。氫醌和苯酚具有美白作用,但同時還具有皮膚刺激性和致敏性,長期使用會損傷心血管及中樞神經系統,甚至有潛在的致癌風險[2,5],已經被我國《化妝品安全技術規范》列為禁用物質[6]。在一定環境條件下,熊果苷可被分解形成氫醌[7-11],基于安全考慮,歐盟消費者安全科學委員會(SCCS)建議β-熊果苷在面霜中最高添加量為7%(質量分數,以下殘留量、添加量均為質量分數),氫醌最高殘留量為0.000 1%[10];α-熊果苷在面霜中最高添加量為2%,潤膚露中最高添加量為0.5%[11]。目前我國《化妝品安全技術規范》中對熊果苷的種類規格、使用限量、理化檢測方法、功效評價方法等均未進行規定,導致無法對該類產品的安全風險進行科學評估。

祛斑美白類化妝品在我國需求量大,消費者和媒體的關注度高,但相關產品質量良莠不齊,管理及使用均不規范。為了更好地對這類產品進行安全性評價,有必要建立化妝品中α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚同時測定的方法,為祛斑美白類化妝品的標準制定和風險評估提供技術支持。

熊果苷的測定方法主要為高效液相色譜法[12-16]和毛細管電泳法[17]。氫醌和苯酚的測定方法主要為高效液相色譜法[16,18]、氣相色譜法[19]和氣相色譜-質譜法[8,20]等。同時測定化妝品中熊果苷、氫醌和/或苯酚的方法多為高效液相色譜法[21-23],而相關文獻中涉及的熊果苷均為β-熊果苷。目前能夠分離并測定祛斑美白類化妝品中α-熊果苷和β-熊果苷這兩種差向異構體并同時檢測氫醌和苯酚的檢測方法尚不多見,已有報道的分析方法[16,21]也存在α-熊果苷和β-熊果苷達不到基線分離的問題。鑒于此,本工作選擇了對異構體有較強分離能力的ADME色譜柱作為分析柱,建立了同時測定化妝品中α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚含量的高效液相色譜法,并將該方法應用到102批祛斑美白類化妝品的檢測工作中,以期為該類化妝品中α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚的風險評估提供進一步的科學指導。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters 1260型高效液相色譜儀,配二極管陣列檢測器;AL204 型電子天平;SI Vortex Genie 2型渦旋混勻器;KQ 3200DE 型數控超聲波清洗器;Advance RO＋Pro VF型超純水純化系統。

單標準儲備溶液:分別稱取α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚對照品各10 mg(精確到0.000 1 g),用甲醇溶解并稀釋配制成1 g·L－1的單標準儲備溶液。

混合標準溶液:取α-熊果苷標準儲備溶液1 mL、β-熊果苷標準儲備溶液1 mL、氫醌標準儲備溶液0.2 mL和苯酚標準儲備溶液0.2 mL,置于同一個10 mL 容量瓶中,用甲醇稀釋配制成α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚質量濃度分別為100,100,20.0,20.0 mg·L－1的混合標準溶液。其他所需質量濃度均由此溶液用甲醇逐級稀釋制得。

α-熊果苷對照品的純度為98.0%;β-熊果苷對照品的純度為99.0%;氫醌對照品的純度為99.4%;苯酚對照品的純度為99.9%;甲醇為色譜純。

試驗所用祛斑美白類化妝品樣品采自批發市場、商場、超市、網店,產品外包裝標稱具有祛斑、淡斑、美白、嫩白、透白等功效。

1.2 儀器工作條件

CAPCELL PAK ADME 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm),柱溫25 ℃;流量1.0 mL·min－1;進樣量為10μL。檢測波長:α-熊果苷、β-熊果苷、苯酚均為283 nm,氫醌為290 nm。流動相A 為水,B為甲醇;梯度洗脫程序:0～5.0 min時,A 為96%;5.0～15.0 min 時,A 由96% 降 至10%,保 持5.0 min;20.0～20.1 min 時,A 由10%跳轉至96%,保持5.0 min。

1.3 試驗方法

稱取祛斑美白類化妝品1.0 g(精確到0.000 1 g)于10 mL 具塞比色管中,用甲醇定容至10 mL,振蕩30 s后密塞,超聲提取10 min。冷卻至室溫后,以8 000 r·min－1轉速離心5 min,取上清液過0.45μm 濾膜,濾液按照儀器工作條件測定。

2 結果與討論

2.1 檢測波長的選擇

α-熊果苷和β-熊果苷的最大吸收波長為283 nm,氫醌的最大吸收波長為290 nm,苯酚的最大吸收波長為271 nm。綜合考慮4種物質的響應強度,試驗選擇283 nm 作為α-熊果苷、β-熊果苷和苯酚的檢測波長,290 nm 作為氫醌的檢測波長。

2.2 色譜柱的選擇

試驗考察了X-Bridge C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、CAPCELL PAK ADME 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、CAPCELL PAK PFP色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)等4種色譜柱對加標樣品(α-熊果苷和β-熊果苷加標量為100 mg·kg－1,氫醌和苯酚的加標量為20 mg·kg－1)中4種目標物的分離效果。結果表明:X-Bridge C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)、Zorbax SB C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)和CAPCELL PAK PFP色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)均不能實現α-熊果苷和β-熊果苷的基線分離(分離度小于1.5),而使用CAPCELL PAK ADME 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)分析時,4種目標物均能夠實現很好的分離,且色譜柱特異性良好,雜質對目標物無干擾。因此,試驗選擇的色譜柱為CAPCELL PAK ADME色譜柱(250 mm×4.6 mm,5μm)。

2.3 提取條件的選擇

α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚均易溶于甲醇,因此選擇甲醇作為提取溶劑。為了充分提取樣品中的目標物,試驗考察了超聲提取時間分別為5,10,15,20,25 min 時對面霜(膏霜劑型)和精華水(水劑乳液劑型)兩種化妝品基質中4種目標物的提取效果。結果表明:超聲提取10 min時,4種目標物的提取效果較好;繼續延長超聲提取時間,β-熊果苷含量呈下降趨勢,推測原因為長時間超聲提取產生的熱量造成了熊果苷的分解[16]。因此,試驗選擇超聲提取時間為10 min。

按照試驗方法分析α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚4種目標物的混合標準溶液和標稱含有熊果苷成分的化妝品樣品溶液,所得色譜圖見圖1。

圖1 混合標準溶液和樣品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution and sample solution

2.4 標準曲線、檢出限和測定下限

按儀器工作條件分析α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚混合標準溶液系列,以目標物的質量濃度為橫坐標,其對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明:α-熊果苷和β-熊果苷的質量濃度均在1.0～50.0 mg·L－1內、氫醌在0.5～10.0 mg·L－1內、苯酚在0.2～10.0 mg·L－1內與其對應的峰面積呈線性關系,其他線性參數見表1。

分別以3 倍的信噪比(S/N)計算檢出限(3S/N),以10倍的信噪比計算測定下限(10S/N),α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚的檢出限和測定下限見表1。

表1 線性參數、檢出限和測定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.5 精密度和回收試驗

按照試驗方法分別對面霜(膏霜劑型)和精華水(水劑乳液劑型)空白樣品進行3個濃度水平的加標回收試驗,每個加標水平平行測定6次,計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD),所得精密度和回收試驗結果見表2。

表2 精密度和回收試驗結果(n＝6)Tab.2 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表2可知,回收率為92.0%～112%,RSD 為0.90%～5.8%。

2.6 樣品分析

按照試驗方法對102批市售祛斑美白類化妝品樣品進行檢測,2批樣品檢出禁用組分氫醌,占總樣品數量的2%,其檢出量分別為52.8,43.0 mg·kg－1;在22批樣品中檢出α-熊果苷或β-熊果苷,其中β-熊果苷檢出量為0.01%～4.0%,均未超過SCCS規定的最高添加量(7%);α-熊果苷檢出量為0.01%～4.8%,其中有2批國產面霜中的α-熊果苷檢出量超過SCCS規定的最高添加量(2%)。此外,試驗結果表明有19批樣品存在標簽標識與檢出物質不符的問題,如標簽標識含熊果苷但并未檢出(15批),或者標簽未標識熊果苷但檢出了熊果苷(4批)。化妝品標簽標識作為消費者購買化妝品時重要的參考依據,直接影響消費者對于商品的知情權,如果未按照要求標注成分表內容或者標注的內容與實際成分不符,有可能會產生誤導或誤用的風險。建議有關部門進一步規范熊果苷作為美白成分添加到化妝品產品中的標簽標識要求,并加大對化妝品中添加禁用物質的打擊力度,切實保障消費者的用妝安全。

本工作建立了同時測定祛斑美白類化妝品中α-熊果苷、β-熊果苷、氫醌和苯酚含量的高效液相色譜法,該方法簡便快捷、準確度高,適用于大批量樣品快速測定,可為熊果苷等美白原料使用限量研究、安全評估等工作提供檢測依據和技術支持。