一種用于細胞牽引力測量的Parylene-C微板的制備

趙麗君，董 曉，李曉娜，黃 棣，張全有，侯晉川，陳維毅

(1.太原理工大學 a.生物醫學工程學院生物醫學工程系，納米生物材料與再生醫學研究中心，b.生物醫學工程研究所，材料強度與結構沖擊山西省重點實驗室, c.數學學院，太原 030024；2.北京大學 微電子研究所，北京 100871)

細胞在黏附、鋪展和遷移過程中通過肌動蛋白和肌球蛋白等細胞骨架體系產生牽引力，在炎癥、傷口愈合、血管再生和腫瘤轉移等諸多生物學過程中發揮重要作用[1-2]。在二維平面培養體系中，可根據細胞在遷移或鋪展過程中硅膠膜基底產生的褶皺，或未起皺硅膠膜彈性膜上包被的微米級乳膠小球的位置變化，大致估算細胞所產生的牽引力的大小，但褶皺變形和小球的位移與細胞牽引力之間的關系為非線性，不能采用經典的彈性理論進行分析[3-6]。細胞在軟的凝膠或高分子聚合物彈性基底表面局部黏附產生的牽引力，可采用線彈性連續介質理論進行分析，但細胞產生牽引力的同時會在一定范圍內引起基底發生形變，無法真正獲得局部某個黏附點的牽引力[7]。

鑒于原位生長在組織的細胞，通過黏附與周圍具有三維空間的細胞外基質之間發生相互作用，發展可直接測量并分析三維空間的細胞牽引力方法，將進一步拓展對細胞-細胞以及細胞-微環境之間相互作用等的理解。有學者探索了在細胞上下表面均鋪有包埋熒光粒子的軟凝膠，結合顯微成像技術[8]、在微柱上包被纖連蛋白，通過彈性微柱的形變[9]可檢測細胞在2.5維空間微環境中所產生的牽引力。但真正實現細胞在三維微環境中牽引力的測量仍是一個挑戰。

為解決上述困難，本文將設計并加工一種Parylene-C微板用于細胞的培養與細胞在三維微環境中牽引力的測量研究。 Parylene-C是一種具有保型性淀積特性、化學惰性以及透光性的聚合物[10]，因其具有良好的生物兼容性而開始越來越多地應用于生物研究領域[11]，如作為生物電極的包裹層[12-13]、液體藥物的存儲容器[14-15]以及視網膜移植手術中的輔助材料[16-18]等。2012年日本東京大學研究人員利用細胞牽引力將Parylene-C薄膜折成了很好的立體三維結構，細胞可通過牽張力使薄膜折疊，制備出各種不同形狀的空管結構，主要應用于諸如具有管狀結構的人工血管支架和細胞三維生長環境的構建[19]。該研究為實現三維細胞牽張力的測量提供了很好的啟示，但要應用于單細胞牽張力的測試，在微板的結構和加工工藝上仍需要進一步改進。

本文所設計的Parylene-C微板將采用MEMS微加工方法，通過Parylene-C薄膜的淀積與刻蝕進行制備。本文的Parylene-C微板涉及兩個厚度的Parylene-C組成部分：一對3 μm厚的方形主體部分以及它們之間100 nm厚的連接部分。該連接通常可以通過對3 μm厚的Parylene-C主體部分之間剩余Parylene-C進行第二次刻蝕得到，但由于受限于Parylene-C刻蝕工藝的刻蝕精度與刻蝕均勻性，很難精確控制第二次刻蝕的厚度。本文通過合理的方案設計和技術路線，在第一次刻蝕時將方形區域之間的3 μm厚Parylene-C完全刻蝕掉，然后再淀積一層100 nm厚Parylene-C薄膜并刻蝕出方形區域之間的連接。由于Parylene-C淀積對厚度控制精確度更高，因此可通過該方法精確得到厚度為100 nm的連接區域。通過該方法，本文制備了一種可用于測量單細胞牽張力的Parylene-C微板。

1 微板設計

為實現單細胞空間折疊，微板結構設計如圖1所示。硬度較大的玻璃作為底層，便于微折疊板向培養皿中轉移。中間犧牲層Gelatin(明膠)在37 ℃水中能夠溶解，從而釋放上層Parylene-C微板。上層Parylene-C微板兩側是厚度和邊長分別為3 μm和50 μm的方形Parylene-C區域。Parylene-C微板中間連接處的厚度為100 nm，寬度為5 μm，為兩側板折疊起到柔性連接的作用。

圖1 微板結構示意圖Fig.1 Schematic of microplate structure

2 實驗過程

2.1 微板加工

首先通過第一次刻蝕得到左右兩個間距為5 μm、 厚度為3 μm的方形Parylene-C區域；然后，再淀積一層100 nm厚的Parylene-C，并通過刻蝕所設計微板圖形之外的該層Parylene-C，完成方形區域之間的連接，刻蝕示意圖如圖2所示。

圖2 優化后Parylene-C微板兩次刻蝕示意圖Fig.2 Schematic of the two-step etching of Parylene-C microplate after optimization

優化后的工藝流程如圖3所示。本文使用厚度為450 μm的4英寸玻璃片(型號：BF33)作為微加工基底。采用2 000 r/min轉速在玻片表面旋涂Gelatin，旋涂后需要在95 ℃真空烘箱中加熱40 s.旋涂后，使用真空氣相淀積系統(型號：SCS PDS2010)沉積淀積3 μm厚Parylene-C.第一次旋涂光刻膠使用正性光刻膠(型號：RZJ-304-50)，旋涂采用轉速為2 000 r/min，時間為30 s.旋涂后，需要在95 ℃真空烘箱中加熱40 s.本實驗使用光刻機(型號：SUSS MA-6)對光刻膠進行曝光處理以得到所需圖形，曝光時間為60 s.曝光后進行顯影(顯影液型號：RZX-3038)，顯影時間為80 s.本實驗使用等離子體刻蝕機(型號：ME-6A)刻蝕Parylene-C.刻蝕所用氣體O2，流量為60 mL/min；射頻功率為250 W，刻蝕時間為600 s.刻蝕結束后，使用丙酮浸泡5 min，去除Parylene-C表面殘留的光刻膠。使用真空氣相淀積系統(型號：SCS PDS2010)第二次沉積Parylene-C.為得到100 nm厚的Parylene-C薄膜，需要加入0.16 g原料。第二次旋涂光刻膠使用正性光刻膠(型號：RZJ-304-25)，旋涂采用轉速為3 000 r/min，時間為60 s.旋涂后需要在95 ℃真空烘箱中加熱30 s.本實驗使用光刻機(型號：SUSS MA-6)對光刻膠進行曝光處理以得到所需圖形，曝光時間為7 s.曝光后進行顯影(顯影液型號：RZX-3038)，顯影時間為45 s.本實驗使用等離子體刻蝕機(型號：ME-6A)刻蝕Parylene-C.刻蝕所用氣體為O2，流量為60 mL/min；射頻功率為250 W，刻蝕時間為60 s.刻蝕結束后，使用丙酮浸泡5 min，去除Parylene-C表面殘留的光刻膠，然后用無水乙醇與去離子水清洗，氮氣吹干，得到目標形狀和尺寸的Parylene-C微板。

圖3 微板加工流程圖Fig.3 Fabrication process of microplate

2.2 細胞實驗

在微折疊板上接種細胞之前，先通過光刻膠的剝離工藝在玻璃片上非Parylene-C區域進行MPC聚合物修飾，以阻止細胞在Parylene-C區域之外發生黏附。在光刻膠剝離之后，對微板表面修飾Ⅰ型膠原，以增強其與目標細胞的黏附。成纖維細胞培養采用DMEM培養基(含體積分數10%胎牛血清、10 mg/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)。將細胞接種于Parylene-C微板上，控制細胞濃度，使得每對微板上只生長一個細胞。37 ℃、體積分數為5% CO2條件下培養4 h后換液，培養24 h后進行細胞折疊實驗。

3 結果與討論

3.1 微板加工結果與討論

采用MEMS微加工方法制備的Parylene-C微板如圖4所示，其中圖4(a)是加工后的整體玻璃片，其表面制備有Parylene-C微板陣列；圖4(b)是顯微鏡明場下的微板陣列。

圖4 微板陣列Fig.4 Photo of microplate array

微板中Parylene-C的厚度通過測量與玻璃片一起淀積的硅片上的Parylene-C厚度得到。測量使用設備為膜厚儀(型號：K-MAC ST2000)，設計厚度為3 μm的Parylene-C膜實際測量厚度為(3.32±0.05)μm，設計厚度為100 nm的Parylene-C膜實際測量厚度為(124.3±4.6) nm.

通過該測量結果可知，第二次Parylene-C淀積時，Parylene-C的厚度可以控制在100 nm左右，而第二次刻蝕并未對方形區域之間的Parylene-C進行刻蝕，因此保證了微板設計中3 μm厚方形Parylene-C區域之間100 nm厚Parylene-C柔性連接的實現。

微板中圖形尺寸由掃描電鏡(型號：HITACHI UHR FE-SEM SU8200)拍照并測量得到。測量結果如圖5所示。方形Parylene-C實際測量邊長為(50.9±0.8)μm(設計尺寸為50 μm)，方形Parylene-C對之間實際測量間隔為4.64 μm(設計尺寸為5 μm).

圖5 微板掃描電鏡圖片Fig.5 SEM image of microplate

長度的尺寸誤差是由光刻的曝光與顯影以及Parylene-C刻蝕引入的，成品可以滿足實驗需求。另外，從圖5中可以看出，方形區域之間100 nm厚的Parylene-C柔性連接并未完全與第一次刻蝕后的Parylene-C方形區域之間的凹槽吻合，存在左右偏差，這是由于第二次光刻時與第一次光刻圖形存在2 μm的系統對準精度所致。

3.2 細胞實驗結果與討論

成纖維細胞接種于Parylene-C微板上后，37 ℃、體積分數5%CO2條件下培養24 h，細胞鋪展狀態良好，經顯微操縱器觸發微板后，能成功引起微板折疊，如圖6所示。

圖6 細胞牽引力折疊微板Fig.6 CTFs fold microplate

細胞接種于微板上，能否實現細胞只生長在微板區且每個微板上只有一個細胞生長的效果，主要取決于兩個方面的因素。一是MPC聚合物涂層的修飾是否成功，MPC聚合物的修飾若不均勻或根本未嫁接到非微板區，會導致整個玻片基底上不止微板區有細胞生長，非微板區也會鋪滿細胞；或者即便是單個細胞落在微板區，在完成鋪展后，細胞會因為微板外空間沒有MPC聚合物阻止黏附的作用而生長至微板外，也就是鋪展到非微板區，這樣一個細胞就會橫跨微板區和非微板區。二是細胞懸液濃度的調整，不同的細胞類型，因鋪展后的面積和增殖速度不同，需要摸索不同的接種濃度以達到最佳單細胞生長效果。本實驗中成纖維細胞的細胞懸液濃度經不斷調試后確定為4×104mL-1，每個35 mm培養皿中接種1 mL細胞懸液，能很好地實現整個基底上的單細胞-微板培養。微板陣列被單細胞覆蓋的比率可達75%～80%左右，能為后續單細胞牽引力的測量實驗提供很好的基礎條件。

4 結論

本研究采用MEMS微加工工藝，加工方案經優化設計，通過兩次Parylene-C淀積與刻蝕，最終制備出具有(124.3±4.6) nm柔性連接的Parylene-C微折疊板，從而能很好地實現細胞黏附所引起的微板折疊，有效地避免了微板連接處硬度太高所引起的折疊失敗和后續計算牽張力的誤差。

細胞鋪展和黏附面積很大程度上取決于細胞可黏附區域的大小。本文微板制備工藝可精準控制微板方形區域Parylene-C的厚度和面積，后續的研究將進一步考慮微板面積與細胞黏附面積的關系。微板形狀設計的不同可能也會引起細胞鋪展形態發生改變，進而也會影響細胞與微板的黏附模式。后續嘗試設計多種微板形狀用于對細胞牽張力的測試也是非常必要的。此外，100 nm厚度的Parylene-C微折疊板連接雖然能很好實現細胞對微板的折疊，但建立細胞牽張力與微板折疊角度的定量關系是至關重要的，比如細胞使微板發生折疊后，根據微板的折疊角度，再結合有限元模擬微板折疊相應角度所需的彎矩，即可計算出單細胞牽引力的大小。這將是本文后續研究的重點。

本文細胞實驗證實，Parylene-C微板可用于計算和分析不同類型黏附細胞的牽引張力，為細胞力學生物學領域研究細胞-基質黏附、細胞鋪展、細胞分裂以及細胞力學特性提供了一種有效的測量方法。