基于膠原-瓊脂糖的組織工程表皮替代物構(gòu)建研究

趙雅靜，曹燕燕，2，申治中，菅傲群，桑勝波

(1.太原理工大學(xué) a.信息與計(jì)算機(jī)學(xué)院 微納系統(tǒng)研究中心，b.新型傳感器與智能控制教育部和山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030024；2.河北北方學(xué)院 信息科學(xué)與工程學(xué)院，河北 張家口 075000)

皮膚是人體面積最大的器官，也是人體抵御外部刺激的第一道防線[1]。體外皮膚損傷(如燒傷、凍傷等)，各種皮膚病或其他疾病會(huì)導(dǎo)致皮膚大面積損傷，治療需要大量的皮膚源[2-4]。此外，對(duì)于許多疾病的研究以及藥物的藥理試驗(yàn)、化學(xué)合成物的毒理試驗(yàn)都需要用到皮膚樣品，盡管現(xiàn)在動(dòng)物皮膚在一定程度上可以作為人體皮膚的替代品，但與人體皮膚仍存在差異[5-7]。基于對(duì)皮膚的大量需求和倫理等各方面的考慮，開發(fā)用于皮膚再生的組織工程具有很大的科學(xué)研究和臨床價(jià)值[8-9]。

表皮作為人體皮膚的最外層結(jié)構(gòu)，能有效地防止有害物質(zhì)入侵人體[10]。因此，人們對(duì)體外表皮替代物從生物材料、種子細(xì)胞等方面進(jìn)行了大量的研究。在20世紀(jì)70年代，有研究者通過對(duì)表皮細(xì)胞直接進(jìn)行培養(yǎng)用于創(chuàng)傷治療，但這種方法耗時(shí)長(zhǎng)、創(chuàng)面接受率低，不利于傷口愈合[11]。因而，人們開始用天然的生物材料與細(xì)胞結(jié)合進(jìn)行體外表皮替代物的構(gòu)建。HORCH et al[12]將角質(zhì)形成細(xì)胞接種在膠原膜上形成單層表皮替代物，但無法在體外維持較長(zhǎng)時(shí)間。之后，人們相繼使用殼聚糖、明膠、瓊脂糖等生物材料構(gòu)建表皮替代物，但其生物相容性均低于膠原。因此，選用復(fù)合型生物材料更有利于表皮替代物的構(gòu)建[13]。

膠原是人體皮膚的主要組成成分，維持著人類皮膚的彈性和韌性，同時(shí)具有支撐和保護(hù)作用，而且主動(dòng)參與細(xì)胞的遷移、分化和增殖代謝，具有良好的生物相容性[14]。在皮膚組織工程方面已經(jīng)有了大量的應(yīng)用與研究，但其存在降解速度較快，機(jī)械性能較弱的問題[15-16]。瓊脂糖作為一種天然多糖材料，是一種高親水性聚合物，具有細(xì)胞無毒性、降解緩慢、材料成本低等特點(diǎn)，成膠后具有良好的機(jī)械性能[17-18]。同時(shí)，人類永生化表皮(HaCaT)細(xì)胞作為體外表皮替代物研究的種子細(xì)胞與正常人表皮細(xì)胞特性相似，與正常人表皮細(xì)胞相比更容易進(jìn)行繁殖，能更方便地用于實(shí)驗(yàn)研究[19-21]。因此，可以利用瓊脂糖來提高膠原蛋白的機(jī)械性能，HaCaT細(xì)胞作為種子細(xì)胞來構(gòu)建一種理想的組織工程表皮替代物。

本研究將制備膠原-瓊脂糖的復(fù)合水凝膠作為人類永生化表皮(HaCaT)細(xì)胞的體外三維生長(zhǎng)環(huán)境，并對(duì)制備的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠進(jìn)行體外表征，研究其形貌、理化性能和機(jī)械性能，并對(duì)HaCaT細(xì)胞在其上的生長(zhǎng)狀況進(jìn)行測(cè)試。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 樣品制備

將4 mg/mL的鼠尾Ⅰ型膠原蛋白(collagen from rat tail，Type Ⅰ)酸性溶液在冰上用中和液(0.1 mol/L的NaOH溶液)中和至中性并稀釋至2 mg/mL，在4 ℃條件下保存?zhèn)溆谩－傊?麥克林，上海)溶于95 ℃的去離子水中制得質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的澄清透明溶液，使其在室溫下溫度降至37 ℃，此時(shí)將準(zhǔn)備好的膠原蛋白溶液和瓊脂糖溶液按不同比例進(jìn)行混合(兩者混合后的比例見表1)，混合后的溶液在室溫下靜置凝固，制得膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠。

表1 膠原和瓊脂糖的混合比例Table 1 Ratio of collagen to agarose %

1.2 膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠的性能測(cè)試

1.2.1溶脹率的測(cè)試

將膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架浸入37 ℃的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered solution，PBS)中，24 h后擦干表面多余的水分，測(cè)定此時(shí)支架的濕重W1，根據(jù)公式(1)計(jì)算出支架的溶脹率。

Ws=[(W1-W0)/W0]×100% .

(1)

其中，W0為支架浸泡之前的重量[22]。

1.2.2密度的測(cè)試

測(cè)量膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的重量(W)、半徑(R)和高度(H)，根據(jù)公式(2)來計(jì)算支架的密度[23]。

(2)

1.2.3降解率的測(cè)試

將膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架置于PBS溶液中，放置在37 ℃下，不攪拌。每隔一段時(shí)間取出樣品，烘干后稱量，同時(shí)用新鮮PBS代替原來的PBS溶液。根據(jù)公式(3)計(jì)算支架的降解率。

Dd=((WI-WF)/WI)×100% .

(3)

式中：Dd是降解程度；WI是樣品初始干重；WF是最后的樣品干重。

1.2.4機(jī)械性能的測(cè)試

通過機(jī)械試驗(yàn)機(jī)測(cè)定膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的彈性模量，在室溫下，以0.5 mm/min的恒定變形速率壓縮樣品。采用變形5%～20%時(shí)的應(yīng)力-應(yīng)變曲線的斜率來計(jì)算彈性模量，結(jié)果為7個(gè)膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠樣品的平均值。

1.2.5支架形貌分析

在12～15 kV加速電壓下，用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)分析膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的形貌。在掃描電鏡觀察之前將膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架冷凍干燥并進(jìn)行噴金。

1.2.6活/死細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

將制備好的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架用細(xì)胞培養(yǎng)液(Gibco高糖培養(yǎng)基DMEM加體積分?jǐn)?shù)10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素溶液)浸泡2 h，同時(shí)用紫外光照射進(jìn)行滅菌。得到無菌的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架后，將培養(yǎng)至第三代的HaCaT細(xì)胞(購(gòu)自廣州優(yōu)澤生物技術(shù)有限公司)以1×105cm-2的密度接種在膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的表面，置于培養(yǎng)箱中，3 d后進(jìn)行活/死細(xì)胞染色。先將膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架上的細(xì)胞用PBS洗滌兩次，加入活細(xì)胞染色試劑(Calcein-AM)染色0.5 h，然后將活細(xì)胞試劑吸出后加入死細(xì)胞染色試劑(PI)染色3 min，染色完成后對(duì)細(xì)胞用PBS進(jìn)行清洗，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.7細(xì)胞骨架實(shí)驗(yàn)

對(duì)接種到支架上的細(xì)胞進(jìn)行鬼筆環(huán)肽(Phalliodin)染色，觀察細(xì)胞的骨架。與活/死細(xì)胞實(shí)驗(yàn)接種細(xì)胞過程相同，細(xì)胞在膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架上培養(yǎng)3 d后進(jìn)行鬼筆環(huán)肽染色。將支架上的細(xì)胞用PBS清洗后加體積分?jǐn)?shù)4%的多聚甲醛固定20 min，然后在避光條件下加入染色試劑，室溫下孵育30 min，用PBS清洗后加入DAPI試劑避光孵育10 min，最后用PBS清洗干凈，置于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架形貌分析

為觀察膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的形貌，對(duì)制備的支架冷凍干燥后進(jìn)行了掃描電子顯微鏡測(cè)試，觀察了膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的表面和內(nèi)部(圖1).圖1中膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架干燥后表面是完整的結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供支撐。冷凍干燥后的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠內(nèi)部呈現(xiàn)多孔形態(tài)，表明膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠的內(nèi)部是多孔結(jié)構(gòu)，能為細(xì)胞存儲(chǔ)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及向外界傳遞細(xì)胞產(chǎn)生的代謝物，有利于細(xì)胞的生長(zhǎng)。從SEM的整體結(jié)果來看，膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架無論是其表面的完整結(jié)構(gòu)還是內(nèi)部的多孔結(jié)構(gòu)都有利于HaCaT細(xì)胞在其上面的生長(zhǎng)，有利于進(jìn)一步進(jìn)行表皮替代物的構(gòu)建與研究。

圖1 膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架表面和內(nèi)部SEM圖Fig.1 SEM images of the surface and interior of collagen-agarose composite hydrogel scaffold

2.2 膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的理化性能分析

為研究膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的理化性能，對(duì)支架進(jìn)行了密度、溶脹率、降解率的測(cè)試(圖2)。由圖2(a)可以發(fā)現(xiàn)，瓊脂糖的比例增大，支架的密度增大，這是因?yàn)橘|(zhì)量濃度為2 mg/mL的膠原溶液密度小于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖溶液，將兩種溶液以不同比例混合成膠后密度會(huì)有所差別。總體來看，不同比例的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的密度都在0.8～1 g/cm3之間，存在較小的差異。但隨著瓊脂糖比例的增大，膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的水溶脹差異明顯(圖2(b)).瓊脂糖比例為0時(shí)的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的溶脹率只有7%，而瓊脂糖比例達(dá)50%時(shí)，支架溶脹率達(dá)48%.這種差異的產(chǎn)生是因?yàn)橄啾饶z原而言，瓊脂糖具有更強(qiáng)的吸水性，作為細(xì)胞支架能為細(xì)胞提供更多的水分。膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的降解速率直接影響著細(xì)胞可以在支架上生長(zhǎng)的時(shí)間，圖2(c)是膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架降解率的測(cè)試結(jié)果。隨著時(shí)間的增加，不同比例的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架都有一定程度的降解，但瓊脂糖占比越高，降解的速率越慢。在圖2(c)中，含有瓊脂糖的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架大約留有60%，而瓊脂糖含量為0的支架只有不到35%.因而，含有瓊脂糖的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的理化性能更好。

圖中**表示P<0.01有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異圖2 膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的密度、溶脹率和降解率Fig.2 Density, swelling rate, and degradation rate of collagen-agarose composite hydrogel scaffold

2.3 膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的機(jī)械性能分析

為研究膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的機(jī)械性能，對(duì)不同比例的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架進(jìn)行了彈性模量測(cè)試(圖3).圖3(a)為不同比例膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的應(yīng)力-應(yīng)變曲線圖。可以發(fā)現(xiàn)，壓縮量一定時(shí)，瓊脂糖比例越高，膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的應(yīng)力越大。而且，與瓊脂糖比例為0的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架相比，比例為20%的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠是它的2倍；當(dāng)膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架中瓊脂糖的比例增大到50%時(shí)，膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的應(yīng)力是瓊脂糖比例為0的13倍。由圖3(b)可以發(fā)現(xiàn)，瓊脂糖的比例越大，膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的彈性模量越大，在瓊脂糖的比例達(dá)到50%時(shí)，膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的彈性模量明顯增大。

圖中**表示P<0.01有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異圖3 膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的應(yīng)力-應(yīng)變曲線和彈性模量Fig.3 Stress-strain curve and elasticity modulus of collagen-agarose composite hydrogel scaffold

2.4 膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的生物相容性分析

為了研究膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架的生物相容性，將細(xì)胞接種在支架上3 d后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了活/死染色(圖4)和鬼筆環(huán)肽染色(圖5).由圖4可以觀察得到，隨著瓊脂糖比例的增大，支架上細(xì)胞密度無明顯差異，這說明不同比例的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架都比較適合HaCaT細(xì)胞的生長(zhǎng)。但從死細(xì)胞的圖中觀察發(fā)現(xiàn)瓊脂糖比例越高，膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架上的死細(xì)胞越多。對(duì)細(xì)胞活性而言，瓊脂糖含量為0的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架最適合HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)。如圖5所示，對(duì)膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架上的細(xì)胞進(jìn)行了鬼筆環(huán)肽染色，圖中綠色熒光代表細(xì)胞骨架，藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核。在圖中可以觀察到細(xì)胞呈方形，部分細(xì)胞有分化的趨勢(shì)呈現(xiàn)出三角形，在不同比例的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架上可以看到HaCaT細(xì)胞的分裂。圖5中瓊脂糖比例為0的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架上的細(xì)胞密度最大，可以明顯觀察到細(xì)胞的重疊，HaCaT細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況最好。從細(xì)胞的增殖分化來看，瓊脂糖比例為0的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架最適合HaCaT細(xì)胞的生長(zhǎng)。但對(duì)于體外表皮替代物的構(gòu)建，支架在理化與機(jī)械方面性能的優(yōu)劣也影響著表皮替代物的性能。瓊脂糖比例為35%的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架相比含量為0的支架具有更好的機(jī)械性能，在圖5中也表現(xiàn)出較好的生物相容性，因此，瓊脂糖含量為35%的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架更適合作為表皮替代物。

圖中綠色熒光代表活細(xì)胞，紅色熒光代表死細(xì)胞圖4 膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架上細(xì)胞的活/死染色圖Fig.4 Live/dead staining image of cells on collagen-agarose composite hydrogel scaffold

圖中綠色熒光代表細(xì)胞骨架，藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核圖5 膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架上細(xì)胞的鬼筆環(huán)肽染色圖Fig.5 Phalloidin staining image of cells on collagen-agarose composite hydrogel scaffold

3 結(jié)論

通過制備不同比例的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架，研究其形貌、理化性能、機(jī)械性能以及體外的生物相容性發(fā)現(xiàn)，當(dāng)膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架中兩者的含量分別為65%和35%時(shí)，支架具有良好的理化性能和機(jī)械性能。同時(shí)，HaCaT細(xì)胞在此比例下的膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架上可以進(jìn)行良好的生長(zhǎng)。因而，在膠原-瓊脂糖復(fù)合水凝膠支架中兩者的含量分別為65%和35%時(shí)，能夠同時(shí)兼顧支架的機(jī)械性能和生物相容性，可以作為一種理想的組織工程表皮替代物。