真姬菇液態發酵關鍵影響因素的優化

王焱，連潔，王竟夷，廖曉曉，班立桐，王玉

（天津農學院農學與資源環境學院，天津 300384）

真姬菇（Hypsizygus marmoreus）又名斑玉蕈、玉蕈、海鮮菇等，屬擔子菌亞門（Basidiomycotina）層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales）白蘑科（Tricholomataceae）玉蕈屬（Hypsizygus），分布于日本、歐洲、北美和西伯利亞地區[1]。因其外形美觀、質地脆嫩、味道鮮美，在日本有“香在松口蘑，味在玉蕈”之美譽[2]。真姬菇子實體中蛋白質、粗纖維、粗脂肪等含量較高[3]，具有提高免疫力、預防衰老、抗高血壓、抗癌等功效，是一種可大眾消費的高營養價值、低熱量、低脂肪保健食品[4]。

食用菌作為現代農業的重要組成部分，在不斷發展過程中，食用菌菌種的制備不斷升級，食用菌液態發酵技術已在平菇[5]、金針菇[6]、秀珍菇[7]、杏鮑菇[8]等食用菌中廣泛應用，具有周期短、適于規模化、標準化生產[9]等特點，而目前大部分真姬菇工廠以固體菌種為主，嚴重影響了制種效率。筆者對真姬菇液態發酵工藝進行優化，對全面推進食用菌液體菌種規模化、標準化生產具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株。真姬菇LS，由天津農學院食用菌研究中心保藏。

1.1.2 培養基。斜面培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KH2PO41.5 g/L，VB10.01 g/L，瓊脂20 g/L。種子培養基：葡萄糖10 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，VB10.01 g/L，蛋白胨3 g/L。發酵培養基：玉米粉30 g/L，酵母膏1.5 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，VB10.01 g/L。

1.2 菌種活化與培養

1.2.1 菌種活化。在超凈工作臺中將真姬菇菌種轉接到斜面培養基中，并放置于恒溫培養箱中，25℃條件下培養，活化菌種。

1.2.2 種子液培養。活化斜面接種于250 mL 三角瓶中，25℃，150 r/min 振蕩培養5 d，即為種子液。

1.2.3 液體菌種發酵。5 L 全自動發酵罐，裝液量3.5 L，接種量3%，25℃培養。

1.3 真姬菇液態發酵條件設計

1.3.1 不同發酵方式對真姬菇菌絲生長的影響。設置通氣量為2 L/min，pH 自然，分別采用鼓氣式和轉速200 r/min進行發酵，定時取樣，檢測液體菌種各項指標。

1.3.2 不同pH 對真姬菇菌絲生長的影響。分別控制pH為5.0、6.0 和7.0，定時取樣，檢測液體菌種各項指標。

1.3.3 不同通氣量對真姬菇菌絲生長的影響。分別控制發酵罐通氣量為2、3、4 L/min，定時取樣，檢測液體菌種各項指標。

1.4 液體菌種生物量的測定

采用細胞干重法[10]。將培養皿在80℃烘干至恒重，稱量。吸取10 mL 發酵液，過濾后收集菌絲體，用蒸餾水反復沖洗后，將菌絲體收集于培養皿內，80℃烘干至恒重，稱量。此時培養皿重量差值即為菌絲體生物量（g/L）。

1.5 液體菌種密度（菌絲球數，mycelium pellet number，MPN）的測定

吸取1 mL 發酵液，倒入培養皿中，皿下墊黑色紙方便計數，重復測量3 次，取平均值（個/mL）。

1.6 液體菌種萌發時間測量方法

按照“1.1.2”配制萌發試驗固體培養基，從培養液中隨機夾取5 個菌絲體接種至萌發培養基上，接種后將平板倒置于25℃恒溫培養箱中培養，每隔1 h 觀察1 次，觀測到其有萌發現象時記錄時間，取平均值即為菌絲體萌發時間（h）。

2 結果與分析

2.1 真姬菇最適發酵方式研究

在食用菌液態發酵中，一般都采用機械攪拌、鼓氣式2 種發酵方式。該研究在采用機械攪拌式發酵時發現，真姬菇的菌絲體非常脆弱，機械攪拌槳易將其打碎，導致其無法生長。因此，該研究均采用鼓氣式發酵。

菌絲球的生物量和密度直接影響到液體菌種使用時萌發點的多少。由圖1 可見，在真姬菇液態發酵過程中，菌絲球生物量、密度和直徑呈現相同的變化趨勢，隨著發酵時間的延長逐漸增加后下降。發酵初期，真姬菇菌絲球直徑迅速增大，而生物量和密度變化較小，進入對數生長期后，菌絲球大量繁殖，生物量值和密度迅速上升，發酵130 h 時生物量達到峰值15 g/L，此時菌絲球密度70 個/mL、直徑3 mm，萌發時間維持在7 h。之后，由于營養物質的消耗，溶氧不足，菌絲球基本停止生長甚至自溶，生物量、密度都有所下降。

圖1 鼓氣式發酵下真姬菇液體菌種菌絲球生物量、密度和直徑的變化

2.2 真姬菇液態發酵最適pH的研究

pH 會影響細胞膜的通透性和結構、鹽的溶解性、物質的解離狀態、不同營養物的吸收[11-12]，從而影響細胞生長和代謝物的合成。在食用菌液態發酵中，細胞通常會產生酸性物質引起pH 降低。pH 降低嚴重抑制菌絲生長，進而抑制MPN 積累和提高。因此，通過控制發酵過程的pH，可能會對真姬菇液態發酵效率的提高具有促進作用。

按照“1.3”所述分別控制pH 為5.0、6.0 和7.0 進行真姬菇液態發酵。由圖2～3 可知，真姬菇液體培養時，前20 h液體菌種生物量增長較為平緩，20 h 后生物量迅速上升，呈現先增加后逐漸減少的趨勢，在第110 h 時，發酵液pH=6.0的生物量達到最大值（1.54 g/L），MPN 達到87×103/L。在120 h 內，隨著pH的增加，菌絲球數逐漸降低，當發酵液pH 控制在7.0 時，菌絲球數增長趨于平緩，菌種生物量尚未達到峰值，菌絲生長受到明顯抑制。而pH 控制在5.0 時，液體菌種生物量和菌絲球數與pH=6.0 時相差不大，但均低于pH=6.0，因此真姬菇菌絲受弱酸性影響較小。可見，真姬菇液態發酵最適pH 為6.0。

圖2 pH 對真姬菇液體菌種生物量的影響

2.3 真姬菇液態發酵最適通氣量研究

圖3 pH 對真姬菇液體菌種密度（MPN）的影響

溶解氧影響與微生物呼吸鏈有關的能量代謝，從而影響微生物生長；溶解氧直接參與代謝產物的合成[13]。較大的通氣量有助于菌絲生長，但也會帶來較大的剪切力和泡沫增加等問題。從液體菌種生物量可直觀看出菌絲的生長狀態，此外菌球密度也可以從側面反映出菌絲體的生長狀態。

由圖4～5 可以看出，不同通氣量條件下，真姬菇液體菌種菌球MPN 和菌絲體生物量具有相同的變化趨勢，菌絲體活力越高，生物量越高，密度越大，均在132 h 左右達到峰值，其中通氣量為3 L/min 時生物量最大，為17 g/L，密度達到165 個/mL。而通氣量2 L/min 時，不同發酵時間的生物量和MPN 均小于通氣量3、4 L/min，可見，不能滿足真姬菇液態發酵的需要。真姬菇菌絲球的萌發時間在進入對數期后均縮短，不同通氣量下的菌絲球萌發時間總是在6～7 h 波動（圖6）。因此，真姬菇液態發酵培養最適通氣量為3 L/min。

圖4 通氣量對真姬菇液體菌種生物量的影響

圖5 通氣量對真姬菇液體菌種菌絲球密度的影響

圖6 通氣量對真姬菇液體菌種萌發時間的影響

3 結論

為獲得菌絲生物量高、密度大、萌發速度快的真姬菇液體菌種，探討了不同發酵方式、pH 和通氣量等關鍵因素對真姬菇液態發酵的影響。試驗表明，真姬菇液態發酵過程中，會代謝產生大量酸性物質，導致pH 快速降低，因此菌絲受弱酸性影響較小，可正常生長，而在中性環境中菌絲生長受到抑制，菌球數及生物量較少；在發酵前期，通氣量與菌絲球密度和菌絲體生物量具有相同的變化趨勢，通氣量越大菌絲體活力越高，生物量越高，菌絲球密度越大，但在發酵后期，過大的通氣量導致菌絲老化過快，菌絲球直徑及生物量呈下降趨勢。因此，pH 和通氣量可被視為影響真姬菇液體菌種發酵的關鍵因素。根據試驗結果，在弱酸性條件及通氣量充足的條件下，即pH 控制在6.0、通氣量3 L/min 時，菌絲長勢最好，會形成較高的菌絲體生物量和密度，為真姬菇液態發酵工藝的最優條件。