番茄抗斑萎病毒病基因Sw-5的分子標記及檢測

王濤，張子君，張逸鳴，王曉峰，鄒慶道

（遼寧省農業科學院蔬菜研究所，遼寧沈陽 110161）

番茄斑萎病毒（TSWV）是一種極具破壞性的農作物病毒病原，威脅著全世界的番茄生產。TSWV 是番茄斑萎病毒屬（Tospovirus）的一種RNA 病毒，屬于布尼亞病毒科（Bunyaviridae）。番茄感染TSWV 后莖和葉片發育不良，葉片呈青銅色、卷曲、出現壞死斑點和條紋，產量也隨之大幅度減少甚至絕收。TSWV的傳播媒介主要是西花薊馬，媒介一旦獲毒便終生帶毒，帶毒的成年薊馬感染一棵健康的植株只需30 min[1-2]。由于TSWV的寄主范圍較廣，包含了84 個科1 090 種植物[3]，目前還沒有有效的防控措施。

培育抗病番茄新品種是預防TSWV 最直接有效的方法，研究者在栽培番茄和野生番茄中均發現有TSWV的抗源。迄今為止，已報道的抗病基因有8 個，包括Sw1a，Sw1b，sw2，sw3，sw4，Sw-5，Sw-6 和Sw-7[4-5]，其中只有在秘魯番茄中發現的Sw-5 基因廣泛應用在番茄育種中。Sw-5對TSWV的各種小種均表現出較好的抗性，并且對番茄斑萎病毒屬的其他病毒也具有抵抗作用。攜帶Sw-5的植株可以有效地限制TSWV的擴散，僅在局部位置出現輕微過敏性癥狀。研究者利用RFLP 分子標記將Sw-5 定位在第9 染色體臨近端粒區域的長臂上，位于標記CT71 和CT220 之間[6]。隨后Spassova 等[7]利用圖位克隆法克隆了該基因，Sw-5 和其他許多抗性基因一樣，屬于CC-（NB-ARC）-LRR 結構。此外，研究者還發現Sw-5 基因有5 個連鎖的拷貝序列（Sw-5a-Sw-5e），通過轉基因驗證，單獨Sw-5b 同樣具有抗病性。Dianese 等利用Sw-5 序列的一個InDel 突變，開發出一個共顯性CAPS 標記，該標記的擴增子包含了Sw-5b 啟動子的一段保守序列[8]。Lee 等利用Sw-5b的DNA序列，開發了一個SNP 標記，可以用于鑒定抗感番茄材料[2]。該研究對獲得的1 個連鎖標記進行驗證和體系優化，建立穩定可靠的番茄抗斑萎病毒病基因Sw-5的分子標記鑒定技術體系，為番茄斑萎病毒病抗病育種提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗地概況。試驗設置于遼寧省農業科學院蔬菜研究所沈陽試驗基地，位于123°55′E、41°82′N，海拔50 m，溫帶半濕潤大陸性氣候，全年平均氣溫8.6℃。試驗在連棟大棚中進行，單棚長45 m，寬6 m，脊高3.5 m，鋼架結構，棚膜為聚乙烯無滴膜。大棚內土質為壤土，肥力均勻，灌溉采用地膜下滴灌。

1.1.2 試驗材料及試劑。試驗材料為42 份番茄，包括引進的抗斑萎病毒病自交系（Sw-5/Sw-5）3 份，分別為RE1、RE2、RE3；遼寧省農業科學院蔬菜研究所番茄課題組培育的自交系（感?。? 份，分別為SU1、SU2、SU3；F1雜交種8 份，均來自遼寧園藝種苗有限公司，編號為L1-L8；F2代單株28 份（L9-L36），為性狀優良的抗病F1雜交種（L3）的分離后代。所有供試材料于2020 年3 月播種，4 月底定植于連棟大棚中。

主要試劑包括：500 mmol/L NaOH 溶液，100 mmol/L Tris-HCl 溶液（pH 8.0），10 μmol/L 上下游引物，10×PCR buffer，10 mmol/L dNTP，0.5 U/μL Taq 酶（天根），6×Loading buffer，1×TBE，goodview（賽百盛），瓊脂糖（Biowest）。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取。采用堿解法提取番茄幼苗期葉片DNA，取20 mg 葉片放入2.0 mL 管，加入200 μL NaOH 溶液，在研磨機上研磨2 min，靜置片刻，13 000 rpm 離心3 min，取上清液轉入新的離心管中，加入100 μL Tris-HCl，4℃保存備用。

1.2.2 引物獲得與合成。Sw-5 基因的連鎖分子標記按照Dianese 等[8]設計的CAPS 標記，引物序列（表1）完全按照文獻所提供，并無改動，委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行引物合成。

表1 抗病基因的引物序列

1.2.3 PCR 擴增體系。通過體系優化，最終確定引物的PCR 反應總體系為10 μL，包含DNA 模板2 μL，上下游引物各0.5 μL，10×buffer 1 μL，dNTP 0.25 μL，Taq 酶1U，ddH2O 補足10 μL。PCR 擴增在德國耶拿PCR 儀上進行，反應程序分為3 步，第1 步：94℃預變性5 min；第2 步：94℃變性30 s，54.5℃復性45 s，72℃延伸30 s，35 個循環；第3 步：72℃延伸10 min。PCR 產物加入6×Loading buffer，然后在電泳儀上進行電泳檢測。瓊脂糖凝膠的濃度為3%，goodview 染色，固定電壓120V，電泳時間為20 min，然后將瓊脂糖凝膠取出，在BIO-RAD Gel Doc XR+凝膠成像系統下進行拍照。

2 結果與分析

2.1 Sw-5 連鎖標記的獲得

利用特異引物首先對3 份抗病材料和3 份感病材料進行PCR 擴增，從圖1 可以看出，3 份抗病材料RE1、RE2、RE3 均擴增出574 bp的特異條帶，3 份感病材料SU1、SU2、SU3 均擴增出464 bp的條帶。說明該標記為共顯性標記，含有Sw-5 基因的抗病番茄可以擴增出574 bp的條帶，不含有Sw-5 基因的感病番茄可以擴增出464 bp的條帶。

圖1 3 份抗病和3 份感病材料的PCR 擴增

2.2 F1 雜交種的PCR 檢測

利用特異引物對8 份F1雜交種進行PCR 擴增，結果顯示，5 份番茄擴增出574 bp 和464 bp 兩條帶，分別為L1、L3、L4、L5 和L6，說明這些材料攜帶有雜合抗病基因（Sw-5/sw-5），L8 擴增出574 bp 一條帶，說明該材料攜帶純合抗病基因（Sw-5/Sw-5），L2 和L7 擴增出464 bp 一條帶，說明這2 份材料不含有Sw-5 基因。

圖2 8 份F1 材料的PCR 擴增

圖3 28 份F2 材料的PCR 擴增

2.3 分離材料的PCR 檢測

對28 份F2代分離材料進行鑒定，結果顯示，共獲得抗病材料20 份，其中有6 份（L14、L15、L19、L20、L21 和L25）擴增出574 bp 特異性條帶，為純合抗病材料；有14份（L9、L12、L16、L18、L23、L24、L26、L29、L30、L31、L32、L33、L34 和L36）擴增出574 bp 和464 bp 兩條帶，為雜合抗病材料。其余8 份不含Sw-5 抗病基因。

3 討論

將Sw-5 基因的連鎖分子標記應用在育種實踐中，將極大地提高抗TSWV 番茄試材的鑒定效率，對于番茄育種材料的遺傳改良和新品種培育都具有重要價值。隨著Sw-5 基因的克隆，研究者開發了一些該基因的分子標記。Shi 等[9]根據Sw-5的DNA 序列開發了一個功能性標記，該標記為顯性標記，無法區分雜合個體。Lee 等[2]等根據一個SNP 突變，設計了一對SNP 引物，通過高效溶解曲線可以鑒定抗感番茄材料，然而該方法需要熒光定量PCR，對實驗條件要求較高，且藥品費用昂貴。該文選擇了一個共顯性SCAR 標記，通過驗證，真實可靠，可以在抗病和感病番茄材料中擴增出清晰的特異性條帶，且長度差異明顯，很容易區分抗感帶型。SCAR 標記操作簡單，不需要酶切等其他試驗操作，技術成熟且費用低，因此該標記完全可用于番茄抗TSWV 育種材料的鑒定和篩選。

根據Dianese 等[8]報道，該SCAR 標記可以在含有Sw-5基因的番茄材料上擴增出574 bp 條帶，不含Sw-5 基因的材料上擴增出510 bp 或464 bp 條帶。該文未擴增出510 bp 條帶，其原因可能是該研究選擇的番茄材料有限，未能覆蓋該標記的所有等位基因。

該文對市場上購買的8 份抗TSWV 雜交種進行PCR檢測，發現其中6 份與預期結果一致，其余2 份并未檢測出Sw-5 基因，這2 份材料可能含有其他抗TSWV 基因，或者植株長勢較強，對TSWV 具有一定的耐性。該研究從28份分離材料中篩選出20 份含有Sw-5 基因的單株，通過田間自然發病，這些單株均表現出較好的抗病性，然而這些材料的其他農藝性狀不是十分理想，例如果實偏小，不抗其他病害等。因此需要擴大番茄材料的篩選范圍，同時利用上述SCAR 標記輔助選擇，進行回交轉育，將Sw-5 基因導入到綜合性狀優良的核心育種系中，為培育品質優良多抗的番茄新品種奠定基礎。