1例非肌性肌球蛋白重鏈9基因相關疾病家系并文獻復習*

羅小娟，曹科，陳詩楊，付笑迎，毛曉寧，張艷，李長鋼，陳運生（深圳市兒童醫院，.檢驗科，.血液腫瘤科，廣東深圳518038）

非肌性肌球蛋白重鏈9基因相關疾病（nonmuscle myosin heavy chain 9 related diseases，

MYH9-RD）是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，是由定位于人類染色體22q12.3的編碼非肌性肌球蛋白重鏈ⅡA（nonmuscle myosin heavy chainⅡA，NMMHC-ⅡA）的MYH9基因突變導致的一類疾病。NMMHC-ⅡA及其亞型在血細胞、腎臟、晶狀體和耳蝸等中廣泛存在，參與構成非肌細胞骨架。而在粒細胞、血小板和巨核細胞中僅特異表達NMMHC-ⅡA［1］。MYH9-RD典型血液系統表現為血小板數量減少、巨大血小板和粒細胞異常包涵體“三聯征”和不同程度的出血癥狀，可伴發腎炎、耳聾、白內障和肝功能異常等血液系統外表現，其臨床表型異質性明顯。既往認為獨立的4種不同綜合征，包括Fechtner綜合征（FTNS：MIM 153640）、Sebastian綜合征（SBS：MIM 605249）、Epstein綜合征（EPTS：MIM 153650）、May-Hegglin異常（MHA：MIM 155100），現已被證實均是MYH9基因突變導致的具有連續臨床譜系的不同亞型，統稱MYH9相關疾病（MYH9-RD：MIM 160775）［2］。研 究 表明MYH9基因發生突變的位點多樣且頻率不一，MYH9-RD臨床癥狀表現復雜，基因突變和臨床表型之間的對應關系和病理生理機制尚不明確［3］。經文獻檢索，國內自2001年徐敏等［4］診斷并報道了第一個家系，截至2021年2月已累計報道42例家系。本研究對深圳市兒童醫院發現的1個MYH9-RD家系的致病突變基因和臨床特征進行鑒定分析，發現該家系存在MYH9基因c.5765＋2T＞A（p.R1922Rfs*43）剪接突變，導致Fechtner綜合征，為國內首次發現。

1 對象與方法

1.1 對象 先證者（Ⅲ1，圖1），女，4歲2個月，因“消化不良”于本院消化內科門診就診，既往有“鼻衄”病史，血常規結果：WBC 6.26×109／L，RBC 4.31×1012／L，Hb 130 g／L，PLT 68×109／L，尿常規潛血2＋，尿蛋白±，尿沉渣鏡檢RBC 7～10／HP，尿異形紅細胞占比35%，提示腎源性血尿。血涂片鏡檢見巨大血小板、血小板減少和粒細胞異常包涵體“三聯征”，高度提示MYH9-RD。經本院醫學倫理學委員會批準（批準文號：2021011）和患兒家屬知情同意后，進一步調查家系成員病史資料、臨床特征和實驗室檢查指標，并分析MYH9基因變異情況。

1.2 主要儀器與試劑 XN-L350血細胞分析儀及其配套試劑（日本希森美康公司），BX43顯微鏡（日本奧林巴斯公司），Combi Scan 500全自動尿液分析儀及其配套試劑（德國愛諾公司），C16000全自動生化分析儀及其配套試劑（美國雅培公司），STA-R Evolution全自動血凝分析儀及其配套試劑（法國STAGO公司），CantoⅡ流式細胞分析儀（美國BD公司），LEPU-8800血栓彈力圖儀（樂普公司），Illumina Nextseq500高通量測序儀器（美國Illumina公司）。CD41-PC5、CD42b-FITC、CD62p-PE試劑（貝克曼庫爾特公司）等。

1.3 標本采集與處理 采集研究對象空腹靜脈血2 mL，EDTA-K2抗凝，制作血涂片2張。采集研究對象空腹靜脈血5 mL于干燥管，靜置2 h后3 000 r／min離心5 min取血清，8 h內完成腎功能、肝功能檢測。采集研究對象空腹靜脈血3 mL，枸櫞酸鈉（濃度3.2%）抗凝，2 h內完成血栓彈力圖和凝血分析。收集二次晨尿，2 h內完成尿液常規分析和尿沉渣紅細胞形態檢查。鏡檢由2位有3年以上工作經驗的主管技師共同完成。

1.4 方法

1.4.1 調查收集家系成員病史資料并完善實驗室檢查 按照《全國臨床檢驗操作規程（第3版）》，采用手工法計數血小板數量；血涂片經瑞氏染色后顯微鏡觀察血小板形態和粒細胞異常包涵體，顯微鏡觀察尿沉渣中紅細胞形態。按照儀器和試劑盒說明書檢測，腎功能指標：半胱氨酸蛋白酶抑制劑C（CysC）、肌酐（Cr）、尿酸（UA）；肝功能指標：丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、γ谷氨酰基轉移酶（r-GGT）；凝血四項：凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）、纖維蛋白原（Fib）；檢測血小板膜糖蛋白（GP）Ⅱb／Ⅲa（CD41／61）、GPⅠb（CD42b）和CD62p表達，用血栓彈力圖凝血綜合指數CI評估患者凝血全貌。

1.4.2 MYH9基因突變位點分析 采用芯片捕獲高通量測序方法，以患者外周靜脈血提取基因組DNA，先將DNA打斷并制備文庫，然后通過芯片對MYH9基因編碼區及臨近剪切區的DNA進行捕獲和富集，目標區捕獲高通量測序參數：目標區長度（bp）5 883，目標區覆蓋度100.00%，目標區平均深度（X）146.33，目標區平均深度＞30X位點所占比例100.00%。最后使用高通量測序平臺進行突變檢測。數據解讀規則參考美國醫學遺傳學和基因組學學院（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）相關指南，變異命名參照HGVS建議規則（http：／／www.hgvs.org／mutnomen／）。確定突變位點后，對先證者和家系成員進行Sanger測序驗證。MYH9基因突變位點分析由深圳華大公司臨床檢驗中心完成。

2 結果

2.1 臨床特征和實驗室檢查結果 該家系三代共有4人患病，家系圖見圖1。非近親結婚，第一、二、三代均有患者，符合常染色體顯性遺傳規律。患病成員均有“鼻衄、瘀斑紫癜、外傷血腫或月經量增多”病史，血小板數量均降低，血涂片鏡檢均發現巨大血小板和粒細胞異常包涵體（圖2），存在典型“三聯征”。臨床表現為鏡下血尿和蛋白尿，尿沉渣紅細胞形態分析，可見環形、出芽狀、炸面包圈樣和小紅細胞等異常紅細胞占比增加，提示腎源性血尿。肝腎功能、聽力和眼科檢查正常。PT、APTT、TT、Fib和血小板膜糖蛋白表達正常。血栓彈力圖凝血綜合指數CI值減低。該家系成員臨床癥狀和實驗室檢查結果見表1。

圖1 MYH9-RD患者家系圖

圖2 血涂片細胞形態學特征

表1 MYH9-RD家系成員臨床癥狀和實驗室檢查結果

2.2 MYH9基因突變位點分析 家系中所有患者MYH9基因第40內含子供體剪接位點均發現錯義突變c.5765＋2T＞A（p.R1922Rfs*43），見圖3。且該基因突變與疾病表型共分離，是該家系MYH9-RD的致病突變。

圖3 MYH9基因突變位點檢測結果

3 討論

MYH9基因編碼的NMMHC-ⅡA蛋白結構組成包含N端球部具有ATP酶活性和動力功能的頭部（第2～19外顯子）、頸部連接區（第20外顯子）及C端環狀螺旋桿狀尾部（第21～41外顯子）。目前國內外報道MYH9-RD高達137種致病突變，其中大多數為單核苷酸替代錯義突變，以D1424N、R702C、R1933X和E1841K四種錯義突變最常見，少部分為重復或缺失導致的移碼突變［5-6］。國內已報道的MYH9-RD涉及42個家系16種基因突變類型（見 表2），其 中R702H、D1424N、E1841K、R1933X四種突變合計27個家系（占64%），與國外報道基本相似，提示MYH9基因存在熱點突變，且不同人種和不同地域之間差異不大。本家系MYH9基因第40內含子供體剪接位點發現錯義突變c.5765＋2T＞A，該基因突變與疾病表型共分離，為該MYH9-RD家系的致病突變，為國內首次發現，國際第2例報道［3］。

表2 國內已報道的MYH9-RD家系的基因突變類型（42個家系）

MYH9-RD在pubmed被描述為“伴有或不伴有腎炎或感音神經性聽力損失的巨血小板減少癥和粒細胞包涵體”，臨床表型具有高度異質性。本家系患者具有典型血液系統“三聯征”，伴發血尿、蛋白尿等慢性腎炎癥狀，亞型分類為Fechtner綜合征。研究表明，突變位于NMMHC-ⅡA頭部ATP酶活性和動力區，可影響ATP分解及肌動蛋白牽動能力，血液系統表現為數量更低的血小板和較重的出血傾向，伴發腎炎、耳聾等非血液系統癥狀風險更高且進展更快［27-28］。然而，新近報道的一些位于桿尾區的突變可表現為早發且快進型腎衰竭等嚴重表型［11］。不同家系的相同位點突變或者相同位點不同氨基酸替代導致不同表型［29-30］，同一家系相同突變基因型亦可有較大的表型差異［31］。MYH9-RD表型異質性可能與年齡相關的不同病理進展階段有關，也可能存在環境或者表觀遺傳學等其他遺傳因素影響。本家系突變位點在第40號內含子c.5765＋2T＞A，位于表型較輕的NMMHC-ⅡA尾部區域，但臨床表型為典型“三聯征”伴發腎炎，可能與該突變位點引起c.5765＋51位置的隱蔽剪接供體位點GT的暴露，導致mRNA從內含子40位置插入了50個核苷酸，并在第41外顯子提前出現終止密碼子，導致了移碼并預測異常蛋白p.R1922Rfs*43［3］而非單一氨基酸改變有關。回顧本病例的臨床特征、實驗室檢查和基因診斷過程，血涂片鏡檢發現“三聯征”是關鍵重要環節。巨大血小板可在低倍鏡下迅速被發現，MYH9-RD血小板顆粒無異常，可見粒細胞異常包涵體，與血小板顆粒減少或缺失的灰色血小板綜合征（GPS）和巨大血小板綜合征（BSS）等遺傳性巨大血小板減少癥相鑒別。《血細胞分析報告規范化指南》［32］明確指出：粒細胞內可見異常包涵體合并巨血小板性血小板減少，高度提示MYH9相關綜合征，應建議進一步行MYH9基因檢查。通過規范血細胞分析報告和重視形態學檢查，有望提高MYH9-RD的檢出率。