α－地中海貧血融合基因檢測方法及應用評價*

鞠愛萍，李友瓊，李娜，劉淑賢，梁亮（.廣州市花都區婦幼保健院檢驗科，廣州50800；.廣西壯族自治區人民醫院醫學遺傳與產前診斷中心，廣西南寧500；.廣州市花都區炭步鎮中心衛生院計劃免疫科，廣州5080）

地中海貧血（以下簡稱“地貧”）是一種常見的溶血性單基因隱性遺傳病，主要是由于珠蛋白基因缺陷導致珠蛋白鏈合成減少或缺如而引起的［1］。我國長江以南地區，特別是廣西、廣東、云南、海南是該病的高發區［2-4］。目前臨床實踐中常規使用的檢測試劑盒，主要是針對中國人群的常見基因突變。導致地貧表型的α2珠蛋白融合基因于2013年首次報道［5］，其人群分布尚不清楚，常規試劑盒常不包含該檢測位點，故此突變的臨床檢測是目前所面臨的一個具體問題。本研究采用臨床常規使用的缺口PCR（gap-PCR）、PCR－導流雜交法α－地貧基因檢測試劑盒以及Sanger一代測序技術，檢測2例α2珠蛋白融合基因樣本，探討當前分子診斷常規方法在α－地貧融合基因檢測中的應用。

1 對象和方法

1.1 研究對象 2例α2珠蛋白融合基因樣本來自廣州市花都區婦幼保健院婚育體檢者，其籍貫為廣州花都區，漢族，既往體健，否認輸血史，無貧血貌，均簽署知情同意書。

1.2 標本采集與處理 分別采集2份2 mL靜脈血，EDTA-K2抗凝，1份用于血細胞和血紅蛋白電泳分析，另1份用于地貧基因分析。

1.3 表型分析 在確定儀器運行狀態良好、室內質控在控后，進行血細胞分析和血紅蛋白電泳。觀察紅細胞參數即血紅蛋白（Hb）、紅細胞平均體積（MCV）、紅細胞平均血紅蛋白含量（MCH）；參考區間：Hb，女性110～155 g／L，男性120～160 g／L，MCV 80～100 fL，MCH 26～34 pg。血紅蛋白組分定量以電泳出所有條帶的峰值為100%，各個條帶所占的峰面積作為條帶的相對含量；參考區間：HbA 91.5%～98%，HbF 0～5%，HbA2 2.4%～3.5%。

1.4 地貧基因常規檢測 用gap-PCR法（深圳益生堂公司試劑盒）檢測中國人群常見的4種缺失型α－地貧（--SEA、--THAI、-α3.7、-α4.2）。用PCR－導流雜交法（廣州凱普公司試劑盒）檢測中國人群常見的3種缺失型（--SEA、-α3.7、-α4.2）和3種非缺失型α－地貧（Hb Constant Spring即Hb CS、Hb Westmead即Hb WS、Hb Quong Sze即Hb QS）。

1.5 α珠蛋白基因DNA測序 根據參考文獻［6］設計引物，進行α珠蛋白基因Sanger測序（委托廣州凱普生物公司）。上游引物序列為5′-GCGAGCGG GATGGGCGGGAGT-3′，下游引物序列為5′-TGAGT GCTGTGTTGACCTA-3′。擴增體系50μL（Qiagen公司產品），含5μL 10×PCR buffer，5μL Q-solution，2.5μL 25 mmol／L MgCl2，1.0μL 25 mmol／L dNTPs，1.5 U Taq polymerase，5 pmol上、下游引物。擴增條件：95℃15 min；97℃50 s，60℃1 min，72℃2 min，共35個循環；72℃10 min。采用3500基因分析儀（美國Life公司）進行DNA測序。采用Vector NTI Advance 11分析軟件進行序列分析，將序列與NCBI上參考序列（NG＿000006.1）進行比對。

2 結果

2.1 血液學表型 見表1。紅細胞參數（Hb、MCV、MCH）未見異常，血紅蛋白電泳分析未見異常條帶，HbA和HbA2結果均在參考區間內。

表1 2例α－地貧患者血液學表型和基因型結果

2.2 地貧基因常規檢測 PCR－導流雜交法在-α4.2突變位點可見弱顯影，見圖1A；gap-PCR法未見異常條帶，見圖1B。

圖1 PCR－導流雜交法和gap-PCR法檢測結果

2.3 α珠蛋白基因DNA測序 α2珠蛋白基因測序結果顯示有7個突變位點，分別為nt34528T＞C、nt34532A＞C、nt34535G＞A、nt34538C＞A、nt34546G＞A、nt34556A＞G、nt34662T＞C，見圖2，與報道的α2珠蛋白融合基因結果［5］一致。

圖2 Sanger測序α－地貧融合基因

3 討論

據報道，α2珠蛋白融合基因是在配子生成過程中，α2珠蛋白基因與Ψα1發生了片段重組［5，7］，改變了α2珠蛋白基因的3′UTR，并引起了多聚腺苷酸信號突變，從而產生廣泛的α2珠蛋白基因轉錄本，引起α＋－地貧。此融合基因的序列結構是α2珠蛋白基因中有一段序列與Ψα1一致，涉及7個差異堿基位點，故據此7個差異位點，從而實現此基因的準確檢測分析。

目前的地貧基因診斷臨床實踐中，未將α2珠蛋白融合基因納入檢測位點范圍；且其為α＋－地貧基因，攜帶者通常為靜止型表型特征，這是α2珠蛋白融合基因文獻報道比較少的原因［5-6，8］。因此，α2珠蛋白融合基因的表型篩查和分子診斷是目前所面臨的難題之一。在當前此融合基因未納入常規檢測位點范圍的情況下，若有線索提示其可能存在，進而檢測確定，在某種程度上有一定的實際意義和應用價值。本研究發現，用PCR－導流雜交法檢測2例樣本時，在-α4.2突變位點有弱顯影，顯色程度淡（圖1A），可能會誤判為-α4.2雜合子，但經α－地貧缺失gap-PCR試劑盒復核時，未檢出缺失目的條帶，結果為-α4.2陰性（圖1B）。通過隨后的α2珠蛋白基因DNA測序顯示7個位點發生堿基置換，而確定為α2珠蛋白融合基因，與已有的報道結果一致［5］。經序列比對分析，此差異位點位于缺失型α－地貧基因擴增體系中正常內參序列范圍，很可能是此內參序列與反向點雜交膜上的-α4.2突變位點探針發生了非特異雜交，從而導致PCR－導流雜交法-α4.2位點弱顯影，易誤判讀為-α4.2雜合子。由此可見，PCR－導流雜交法的結果判斷中，-α4.2突變位點的顯色程度須與對照位點基本一致才能判讀為-α4.2缺失突變；弱顯影則提示可能存在其他情況，如本研究中的α2珠蛋白融合基因。PCR－導流雜交法-α4.2位點弱顯影雖然可以提示可能存在α2珠蛋白融合基因，但需要通過基因測序來確證。

本研究中的2例患者均為雜合子狀態，血液表型均未見異常，這提示α2珠蛋白融合基因引起的是α＋－地貧，不會造成貧血。但根據文獻報道，α2珠蛋白融合基因合并--SEA時，可引起血紅蛋白H病［5］，提醒我們在日常地貧篩查和基因診斷中需要注意。因為如果夫妻雙方的一方為α2珠蛋白融合基因，另外一方為輕型α地貧時，可能會有生育血紅蛋白H病患兒的風險。