抗SSA、SSB和CENP-B抗體在系統(tǒng)性紅斑狼瘡及干燥綜合征的發(fā)生率及濃度分析

楊為斌，王江平，梅麗萍，蔡望喜（.武漢市普仁醫(yī)院檢驗科，武漢43008；.湖北中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 湖北省中醫(yī)院檢驗科，武漢43006）

以系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）和干燥綜合征（Sj?gren′s syndrome，SS）等為代表的自身免疫病（autoimmune disease，AID）在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。抗干燥綜合征抗原A（Sj?gren′s syndrome antigen A，SSA）抗體、抗干燥綜合征抗原B（Sj?gren′s syndrome antigen B，SSB）抗體和抗著絲點蛋白B（centromere protein B，CENP-B）抗體對于AID的臨床診斷發(fā)揮重要作用。其中，抗SSA和SSB抗體是SS患者中常見的自身抗體，大約50%～70%的SS患者體內可檢測到上述2種抗體［1］。抗CENP-B抗體則往往被視為系統(tǒng)性硬化癥（systemic sclerosis，SSc）臨床診斷的血清學標記物，該抗體在CREST綜合征的發(fā)生率高達50%～90%［2］。上述3種抗體在不同疾病中的發(fā)生率已有不少文獻報道，但已有的研究數據均基于傳統(tǒng)免疫學檢測方法獲得，包括對流免疫電泳、免疫雙擴散、免疫印跡法或酶聯(lián)免疫吸附法等。在國內大部分臨床實驗室在開展抗SSA、SSB和CENP-B抗體檢測時，仍然沿用傳統(tǒng)免疫印跡法開展定性檢測。近年來，具有全自動、定量、隨機上樣和靈活組合等特點的化學發(fā)光法（chemiluminescent immunoassay，CLIA）被逐步應用到自身抗體的臨床檢測領域［3-4］。本研究同時采用CLIA和ELISA對上述3種抗體在SLE和SS等患者人群中的發(fā)生率和濃度展開對比研究。同時比較CLIA和ELISA兩種方法在檢測上述抗體時的符合率。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本 收集2017年1月至2019年6月期間湖北省中醫(yī)院就診的531例SLE患者（女480例，男51例，平均年齡36歲）、96例SS患者（女92例，男4例，平均年齡50歲）和93例本院職工體檢健康人群（healthy individual，Hi）（女56例，男37例，平均年齡43.5歲）血清樣本，樣本采集后直接檢測或－20℃保存。入組患者的臨床診斷均嚴格遵循相關疾病的臨床分類標準［5-6］。其中，Hi組均自述無自身免疫相關疾病病史，且血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功能和免疫指標（含免疫球蛋白和補體）等常規(guī)體檢指標未見異常。本研究已通過湖北省中醫(yī)院倫理委員會的倫理審查，所有受試者均簽署知情同意書。所有樣本同時采用CLIA和ELISA開展抗SSA、SSB和CENP-B抗體的檢測。

1.2 試劑和儀器 CLIA自身抗體檢測系統(tǒng)：全自動化學發(fā)光分析儀（Smart 6500，重慶科斯邁公司）及配套的抗SSA、SSB和CENP-B抗體CLIA檢測試劑盒（江蘇浩歐博公司）。ELISA檢測：SUNRISE酶聯(lián)儀（瑞士TECAN公司）及抗SSA、SSB和CENP-B抗體ELISA檢測試劑盒（德國歐蒙公司）。

1.3 方法

1.3.1 CLIA法檢測抗SSA、SSB和CENP-B抗體

均按照試劑說明書操作，在全自動化學發(fā)光分析儀（Smart 6500）上檢測。臨界值均為20 RU／mL。

1.3.2 ELISA法檢測抗SSA、SSB和CENP-B抗體 血清標本1∶201稀釋，加入包被特定靶抗原的微孔板中，室溫反應30 min，用清洗緩沖液清洗3次，每孔加入100μL酶標記的抗人IgG抗體，室溫反應30 min，用清洗緩沖液清洗3次，每孔加入100μL 3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺底物液，室溫反應15 min，最后加入100μL終止液，在酶聯(lián)儀中以450 nm和620 nm雙波長測量吸光度測量。根據吸光度值計算抗體濃度并判讀陰陽性結果。所有ELISA抗體的檢測臨界值均為20 RU／mL。

1.3.3 統(tǒng)計學分析 用SPSS21.0軟件進行。相關組別的抗體濃度比較采用t檢驗分析；不同樣本組抗體發(fā)生率差異采用χ2檢驗。不同方法檢測結果差異的比較，采用四格表的χ2檢驗，兩種方法檢測結果一致性的分析采用Kappa檢驗，一致性強度的判斷：當Kappa＜0.4，一致性強度較差；0.4≤Kappa＜0.75，兩者一致性一般；Kappa≥0.75兩者一致性較好。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 抗SSA、SSB和CENP-B抗體在SLE和SS的發(fā)生率及濃度 CLIA法結果顯示：SLE患者組的抗體發(fā)生率分別為63.3%、17.5%和9.2%，SS患者組的抗體發(fā)生率則分別為84.4%、40.6%和7%。抗SSA和SSB抗體在SS患者組的發(fā)生率均高于SLE患者組（P＜0.01），而抗CENP-B抗體在上述2種疾病中的發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。抗SSA抗體濃度在上述兩組患者中差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.09），而抗SSB和CENPB抗體的濃度差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表1和表2。

表1 抗SSA、SSB和CENP-B抗體在不同疾病組的抗體發(fā)生率比較

表2 抗SSA、SSB和CENP-B抗體在SLE和SS患者的抗體濃度比較（ˉx±s，RU／mL）

2.2 抗SSB抗體和抗SSA抗體的相關性 入組樣本中抗SSB抗體陽性134例，其中抗SSA抗體陰性而抗SSB抗體陽性的例數僅為4例。結果表明，無論是在SLE還是SS患者人群中，抗SSB抗體的發(fā)生總是伴隨抗SSA抗體的存在，呈現(xiàn)對抗SSA抗體的高度依賴性（P＜0.05）。見表3。

表3 抗SSB抗體伴隨抗SSA抗體發(fā)生率［n（%）］

2.3 CLIA和ELISA 2種方法檢測抗SSA、SSB和CENP-B抗體的符合率 本研究對所有樣本同時平行開展CLIA和ELISA檢測。結果顯示，CLIA和ELISA在檢測上述3種抗體時總符合率分別為96.4%、95.7%和98.3%（Kappa＞0.85），提示CLIA和ELISA 2種方法對3種抗體的檢測結果具有可比性。見表4。

表4 CLIA與ELISA檢測抗SSA、SSB和CENP-B抗體的符合率（%）分析

3 討論

隨著環(huán)境的改變以及老齡化程度的增加，國內AID的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢。在臨床實踐中，與AID相關的自身抗體實驗室檢測結果對于疾病的臨床診斷和治療監(jiān)測發(fā)揮重要作用。抗SSA抗體和抗SSB抗體由于在SS患者中具有較高的發(fā)生率，因此對SS的臨床診斷具有重要價值。而抗CENP-B抗體則被認為是SSc的重要血清學標記物。已有的研究表明，上述3種抗體在包括SLE、原發(fā)性膽汁性膽管炎、類風濕關節(jié)炎等AID中均有不同的發(fā)生率［7-9］。但大部分針對上述抗體發(fā)生率研究所采用的方法學均為傳統(tǒng)免疫方法，例如免疫雙擴散法、對流免疫電泳、ELISA或免疫印跡法（line immunoassay，LIA）等。不同檢測方法學由于檢測原理不同，因此不同方法學檢測結果往往容易存在差異。目前，國內針對上述3種抗體在SLE和SS發(fā)生率和濃度的研究比較少見。本研究應用CLIA和ELISA方法對臨床確診的患者開展上述3種抗體的平行檢測，從而探討上述3種抗體在國內SLE和SS患者的抗體發(fā)生率以及濃度。結果顯示，抗SSA和SSB抗體在SLE和SS患者組中均具有較高的發(fā)生率，抗SSA抗體的發(fā)生率分別為63.6%和84.4%，抗SSB抗體的發(fā)生率分別為17.5%和40.6%。本研究中抗SSB抗體在SS確診患者組中的發(fā)生率明顯高于Yang等［10］采用LIA方法的研究結果（25.3%）。值得注意的是，抗SSB抗體不僅發(fā)生率SS患者組高于SLE組，而且該抗體在SS組中的濃度顯著高于SLE患者（P＜0.01）。在臨床實踐中，SS患者包括原發(fā)和繼發(fā)兩類患者。其中，17.8%的SLE患者可繼發(fā)出SS，從而在臨床表現(xiàn)出上述2種疾病的重疊（SLE-SS）。SLE-SS與單獨SLE相比較，不僅臨床表現(xiàn)有所不同，而且自身抗體的表現(xiàn)也存在差異，其中抗SSA和SSB抗體在SLE-SS患者組中的發(fā)生率明顯高于單獨SLE組［11］。本研究結果顯示，抗SSB抗體在SS患者組的發(fā)生率和濃度均顯著高于SLE組，提示與抗SSA抗體相比，抗SSB抗體在SS疾病的發(fā)病過程中可能發(fā)揮更重要的作用。

已有的研究表明，抗SSA抗體和抗SSB抗體具有不同的疾病特異性。前者在多種AID疾病中均有一定的發(fā)生率，包括SLE、SS和類風濕關節(jié)炎等，而后者則對SS具有更高的疾病特異性。在本研究中，抗SSB抗體盡管在SS的發(fā)生率明顯高于SLE，但該抗體的出現(xiàn)始終伴隨著抗SSA抗體的陽性。作為真核細胞內的重要核糖核蛋白分子，SSA和SSB抗原在結構上具有一定的關聯(lián)性。天然的SSA和SSB抗原的共同特點都是由一個核糖核蛋白與特定小分子核酸（hY-RNAs）組成的復合物。與SSA抗原中相對分子質量為60 000的蛋白質分子相結合的hY-RNAs分子，同時也具有與SSB抗原中相對分子質量為48 000的蛋白質分子結合的位點。相對分子質量為60 000和48 000的結合蛋白的分子量不同，但由于可結合在同一hY-RNAs分子上，因此在抗原結構上相關性也使得其臨床發(fā)生率具有一定的相關性［12］。本研究中所使用的CLIA方法在檢測抗SSA和SSB抗體時均使用天然抗原，而檢測結果也顯示出抗SSB抗體的發(fā)生率具有抗SSA抗體的依賴性。最近的研究表明，抗SSA抗體與SLE患者的頭疼、視力模糊以及疾病活動度相關，而抗SSB抗體則與SLE患者的頭疼和疾病活動度相關，且上述2個抗體在SLE患者中往往同時出現(xiàn)［13］。對于單獨抗SSA抗體陽性的SLE和SS患者與2個抗體同時陽性的患者之間，是否存在更多的臨床差異（包括臨床表征、疾病進程和療效預后等），仍需要更多的臨床分組研究具體解答。

抗CENP-B抗體一直以來都作為SSc疾病的血清學標志物，尤其與具有鈣化、雷諾現(xiàn)象、食管運動障礙、指端硬化和毛細血管擴張為主要表現(xiàn)的CREST綜合征高度相關。越來越多的研究表明，抗CENP-B抗體同樣可以在其他自身免疫疾病中出現(xiàn)，包括SLE、SS、原發(fā)性膽汁性膽管炎和類風濕關節(jié)炎等。隨著研究的不斷深入，抗CNEP-B抗體陽性的SS患者與抗體陰性患者相比，由于具有雷諾現(xiàn)象、指端硬化和合并自身免疫甲狀腺炎的概率更高，因此該抗體陽性的SS患者被視為一個獨特的臨床 亞 型［14］。Respaldiza等［15］研 究 顯 示，抗CENP-B抗體在SLE的發(fā)生率僅為1.9%。在本研究中，抗CENP-B抗體在SLE的發(fā)生率高達9.2%。差異造成的原因有可能是Respaldiza等［15］的研究所采用的方法學均為傳統(tǒng)的檢測方法，包括間接免疫熒光法、ELISA、western blot等，對于抗CENP-B抗體的檢測敏感性偏低。

本研究對所有樣本同時采用CLIA和ELISA平行檢測結果顯示，2種方法在檢測上述3種抗體時表現(xiàn)出良好的符合率和一致性。盡管CLIA和ELISA在抗原包被和反應原理上存在一定的差異，但由于2種方法針對上述3種抗體的檢測均采用了相同來源的抗原成分（SSA和SSB均采用天然抗原，而CENP-B同為重組抗原），確保2種方法學在檢測上述3種抗體時具有良好的符合率。實驗室開展自身抗體檢測方法學選擇之前，應根據方法學性能參數等多因素綜合評判。