抗核抗體熒光核型在原發性膽汁性膽管炎和自身免疫性肝炎篩查中的作用評估*

王之青，鄭冰（上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院檢驗科，上海200127）

抗核抗體（antinuclear antibodies，ANA），又稱抗細胞抗體（anti-cellular antibody，AC），是包括針對真核細胞內各種抗原成分的自身抗體總稱，其對自身免疫病具有較高的診斷敏感性。人喉鱗狀細胞癌細胞系Hep-2（Human epithelial type 2）細胞含有數百種天然抗原，以Hep-2細胞為底物的間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）可檢測患者血清中不同自身抗體，并呈現相應的熒光核型［1］。國際抗核抗體熒光核型共識（international consensus on ANA patterns，ICAP）目前定義并命名了30種熒光核型，每種核型名稱以AC（anticell）開頭（AC-0～AC-29），并在ICAP網站（www.ANApatterns.org）歸納了不同熒光核型所對應的臨床意義［2］。該工作對于闡述ANA熒光核型的免疫學相關性和優化IFA檢測在患者疾病診斷中的應

用具有重要意義。本研究通過分析原發性膽汁性膽管炎（primary biliary cirrhosis，PBC）和自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）患者ANA熒光核型的檢出情況，評估HEp-2 IFA在PBC和AIH患者疾病篩查中的意義及相關核型與特異性自身抗體檢出率的相關性。

1 材料和方法

1.1 研究對象 選取上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院2019年4—12月進行自身免疫性肝病（autoimmune liver disease，ALD）篩查試驗并明確診斷為PBC和AIH的患者，排除臨床信息不全的樣本。PBC和AIH的診斷依據分別為2017年歐洲肝病學會臨床實踐指南［3］和2015年我國AIH診斷和治療共識［4］。PBC患者106例，年齡（53.3±11.4）歲，其中女性92例（86.8%），男性14例（13.2%）；AIH患者138例，年齡（52.1±12.8）歲，其中女性120例（87.0%），男性18例（13.0%）。

1.2 試劑與儀器 自身抗體譜IgG檢測試劑盒（IFA）、ALD IgG類抗體檢測試劑盒（免疫印跡法，德國歐蒙公司），抗肌動蛋白IgG抗體檢測試劑盒（酶聯免疫法，美國INOVA公司）；Sprinter-XL全自動分析儀、EUROLineMaster Plus-A全自動免疫印跡儀（德國歐蒙公司）。

1.3 方法 用IFA法檢測血清ANA、抗線粒體抗體（anti-mitochondrial antibody，AMA）和抗平滑肌抗體（anti-smooth muscle antibody，ASMA），用自身抗體譜IgG檢測試劑盒在Sprinter-XL全自動分析儀上進行檢測。按試劑說明書，滴度≥1∶100判為陽性。ANA熒光核型判讀依據ICAP所定義的30種熒光核型（AC-0～AC-29）。

用免疫印跡法檢測ALD相關特異性抗體，采用ALD IgG類抗體檢測試劑盒在全自動免疫印跡儀EUROLineMaster Plus-A進行檢測和結果判讀。特異性抗體譜包括：線粒體抗體M2亞型（AMA-M2）、肝溶質抗原1型（LC-1）抗體、肝腎微粒體抗體（LKM-1）、2－丙酮酸脫氫酶（M2-3E）抗體、早幼粒細胞白血病蛋白（PML）抗體、Ro52抗體、可溶性肝抗原／肝胰抗原（SLA／LP）抗體、斑點蛋白（Sp100）抗體和糖蛋白210（gp210）抗體，結果判定依據試劑說明書。

用酶聯免疫法檢測抗F-肌動蛋白抗體，用抗肌動蛋白IgG抗體檢測試劑盒在Sprinter-XL全自動分析儀上進行檢測。結果判定依據試劑說明書。

1.4 統計學分析 用SPSS 22.0、GraphPad Prism 5.01軟件進行。計數數據用例數（n）、百分率（%）進行描述，皮爾森卡方檢驗或Fisher確切概率法分析；正態分布計量數據用均數±標準差（ˉ±s）表示，用t檢驗分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ANA檢出率及主要核型分析 PBC和AIH患者ANA檢出率分別為91.5%（97／106）和68.8%（95／138）。PBC患 者 中 單 一 核 型 占37.7%（40／106），混合核型占53.8%（57／106）。單一核型中，檢出率前三位是胞漿網狀／線粒體樣型（AC-21）［13.2%（14／106）］、粗顆粒型（AC-5）［4.7%（5／106）］以及均質型（AC-1）、細顆粒型（AC-4）、點 狀 核 膜 型（AC-12）［均 為3.8%（4／106）］；混合核型檢出率最高的為著絲點型（AC-3）合并AC-21［13.2%（14／106）］。

AIH患者中單一核型占43.5%（60／138），混合核型占25.4%（35／138）。單一核型中，檢出率最高的是細顆粒型（AC-4）［14.5%（20／138）］；混合核型檢出率最高的為AC-12合并AC-21［8.0%（11／138）］。

PBC和AIH患者不同單一核型中的檢出率見表1。熒光核型在PBC和AIH患者中檢出率（包括在單一核型和復合核型中出現情況）見圖1。

圖1 不同熒光核型在106例PBC和138例AIH患者中的檢出率

表1 不同熒光核型在PBC和AIH患者中分布

2.2 胞漿網狀／線粒體樣型和胞漿顆粒型與AMA 用106例PBC患者中，以鼠腎為基質的IFA法檢測AMA的檢出率為61.3%（65／106），而以HEp-2為基質的IFA熒光核型表現為胞漿網狀／線粒體樣型（AC-21）的檢出率為50.9%（54／106），兩者檢出率差異無統計學意義（P＞0.05）。IFA熒光核型判讀為AC-21的樣本中AMA（IFA法）檢出率為90.7%（49／54），其中滴度1∶100、1∶320和1∶1 000分別為18.5%（10／54）、40.7%（22／54）和31.5%（17／54）。LIA法檢測AMA-M2與抗M2-3E抗體在AC-21核型中檢出率分別為87.0%（47／54）和94.4%（51／54）。AC-21核型中，AMA（IFA法）、AMA-M2和抗M2-3E抗體均陰性樣本占1.9%（3／54）。

其他胞漿顆粒型熒光核型，包括胞漿散點型（AC-18）、胞漿致密顆粒型（AC-19）和胞漿細顆粒型（AC-20），AMA（IFA法）檢出率分別為0、100.0%（2／2）和25.0%（1／4）。AMA-M2（LIA法）在AC-18、AC-19和AC-20熒光核型中檢出率分別為0、50.0%（1／2）和25.0%（1／4）；抗M2-3E抗體（LIA法）在上述3種核型中檢出率分別為0、100.0%（2／2）和25.0%（1／4）。

除AC-21核型以及3種胞漿顆粒型熒光核型以外，其他熒光核型和ANA陰性（AC-0）樣本AMA（IFA法）檢出率分別為36.8%（14／38）和0；AMA-M2（LIA法）檢出率分別為15.8%（6／38）和11.1%（1／9）；抗M2-3E抗體（LIA法）檢出率分別為34.2%（13／38）和0。AMA在上述各種ANA核型中檢出率結果見表2。

表2 PBC患者中AMA在AC-21熒光核型與其他核型中的檢出率分布

138例AIH患者中，AMA（IFA法）檢出率為19.6%（27／138），而熒光核型表現為AC-21的檢出率為50.9%（25／138），兩者檢出率差異無統計學意義（P＝0.758）。熒光核型判讀為AC-21的樣本中AMA（IFA法）檢出率為88.0%（22／25），其中滴度1∶100、1∶320和1∶1 000分別為12.0%（3／25）、44.0%（8／25）和32.0%（8／25）。LIA法 檢 測AMA-M2與抗M2-3E抗體在AC-21核型樣本中檢出率分 別為72.0%（18／25）和88%（22／25）。AC-21核型中，AMA（IFA法）、AMA-M2和M2-3E均陰性樣本占12%（3／25）。

其他胞漿顆粒型熒光核型（AC-18、AC-19和AC-20），AMA（IFA法）檢出率分別為100.0%（1／1）、25.0%（1／4）和20.0%（1／5）。AMA-M2（LIA法）在AC-18、AC-19和AC-20熒光核型中檢出率分別為0、25.0%（1／4）和40.0%（2／5）；抗M2-3E抗體（LIA法）在上述3種核型中檢出率分別為100.0%（1／1）、0和33.3%（2／5）。

除AC-21以及3種胞漿顆粒型熒光核型以外，其他熒光核型和ANA陰性（AC-0）樣本，AMA（IFA法）檢出率分別為3.3%（2／60）和0；AMA-M2（LIA法）檢出率分別為3.3%（2／60）和0；抗M2-3E抗體（LIA法）檢出率分別為3.3%（2／60）和0。抗線粒體抗體在上述各種ANA核型中檢出率結果見表3。

表3 AIH患者中AMA在AC-21熒光核型與其他核型檢出率分布

2.3 核點型與抗Sp100和抗PML抗體 106例PBC患者中，10.4%（11／106）ANA熒光核型為核多點型（AC-6），3.8%（4／106）為核少點型（AC-7）。抗Sp100抗體和抗PML抗體在AC-6檢出率均明顯高于AC-7以及除AC-6和AC-7以外的其他ANA核型。138例AIH患者中，1.4%（2／138）ANA熒光核型為核多點型（AC-6），0.7%（1／138）為核少點型（AC-7）。抗Sp100抗體在AC-6檢出率均明顯高于AC-7以及除AC-6和AC-7以外的其他ANA核型。見表4。

表4 PBC患者中抗Sp100抗體和抗PML抗體在AC-6熒光核型與其他核型檢出率分布

2.4 點狀核膜型與抗gp210抗體 106例PBC患者中，24.5%（26／106）ANA熒光核型為點狀核膜型（AC-12），光滑核膜型（AC-11）未檢出。抗gp210抗體在AC-12檢出率明顯高于其他ANA核型。138例AIH患者中，16.0%（17／106）ANA熒光核型為點狀核膜型（AC-12），光滑核膜型（AC-11）未檢出。抗gp210抗體在AC-12檢出率明顯高于AC-11及除AC-11和AC-12以外其他ANA核型。見表5。

表5 PBC患者中抗gp210抗體在AC-12熒光核型與其他核型檢出率分布

2.5 胞漿纖維型與ASMA和抗F－肌動蛋白抗體 106例PBC患者中，未檢出胞漿線性／肌動蛋白型（AC-15）熒光核型。138例AIH患者中，1.5%（2／138）ANA熒光核型為胞漿線性／肌動蛋白型（AC-15），0.7%（1／138）為 胞 漿 絲 狀／微 管 型（AC-16），胞漿節段型（AC-17）未檢出。ASMA和抗F－肌動蛋白在AC-15中的檢出率明顯高于AC-16和除AC-15、16和17以外的其他核型。見表6。

表6 AIH患者中ASMA和抗F－肌動蛋白抗體在AC-15熒光核型與其他核型檢出率分布

3 討論

IFA法檢測抗核抗體對自身免疫病篩查具有重要作用，其檢測結果中包括抗體滴度和熒光核型。其中，抗體滴度與患者體內ANA含量呈一定相關性，雖然一般人群中也存在低滴度ANA［5］，但系統性自身免疫病患者體內一般為中、高滴度抗體；而熒光核型則與特定樣本中所含的特異性自身抗體有關，有助于自身免疫病的診斷與鑒別診斷。ICAP目前共定義了30種熒光核型，且依據判讀的難易程度將30種核型分為必報核型和選報核型［2］。而2018年由中國醫師協會風濕免疫科醫師分會自身抗體檢測專業委員會發布的《抗核抗體檢測的臨床應用專家共識》［6］中明確指出，由于ALD在我國發病率較高，建議將ICAP所規定核膜型（AC-11／12）和胞漿線性／肌動蛋白型（AC-15）熒光核型，由選報核型變為必報核型。因此，本研究通過分析PBC和AIH患者中ANA熒光核型和特異性自身抗體檢測的相關性，評估熒光核型在ALD篩查中的作用。

本研究中，PBC患者ANA檢出率91.5%，且陽性樣本中大部分為混合核型，而AIH患者ANA檢出率僅68.8%，陽性樣本中以單一核型為主。Wei等［7］對中國137名PBC患者和57名AIH患者進行ANA熒光核型分析，其中PBC患者混合核型占33.6%，而AIH患者混合核型僅3.5%，與本研究結果相似。另外，AC-21核型是PBC患者中最常見的ANA核型，且在AIH患者中也有18.1%的檢出率，而其他胞漿顆粒型（包括AC-18／19／20）檢出率僅0～3.8%。在PBC患者中AC-21熒光核型血清中AMA（IFA法）、AMA-M2和M2-3E檢出率分別為90.7%、87.0%和94.4%，明顯高于胞漿顆粒型AMA檢出率（25.0%）和其他熒光核型（除外AC-18／19／20／21）AMA檢出率（15.8%～36.8%）。因此，實驗室對AC-21核型的準確判讀，對后續進行AMA抗體檢測具有重要提示作用。臨床實驗室應將該核型作為實驗室必報熒光核型，并與其他胞漿顆粒型（包括AC-18／19／20）進行區分。

核膜型在ICAP定義中分為光滑核膜型（AC-11）和點狀核膜型（AC-12），兩者對應靶抗原不同。前者主要靶抗原為核纖層蛋白，臨床尚無商品化檢測試劑盒，可于健康人中檢出且無疾病特異性［2］；后者主要靶抗原為抗核孔復合體抗體，如gp210、nup62和Tpr，其中抗gp210抗體是PBC患者特異性診斷標志，可在9.4%～41.2%的PBC患者中檢出，而健康人群和其他疾病人群中檢出率僅0～0.4%［8］。本研究中，AC-12在PBC患者中檢出率24.5%，位居第二，且未檢出光滑核膜型（AC-11）；PBC患者中AC-12樣本抗gp210抗體檢出率高達95.2%，而非核膜型抗gp210抗體檢出率僅21.1%。因此，準確識別AC-12核型，對于后續PBC相關抗體檢測具有重要意義。但由于HEp-2間期細胞核通常呈細顆粒樣染色，AC-12易誤判為核顆粒型；另外胞漿網狀／線粒體樣型熒光核型也會對核膜型的判讀造成干擾。此時，以猴肝細胞為基質的熒光片可以輔助判讀，通常情況下核膜型可在猴肝細胞核外圈有明顯核膜染色。

核多點型（AC-6）對應的靶抗原主要為Sp100和PML，兩者常共同檢出于PBC患者；核少點型（AC-7）對應的靶抗原主要為p80－螺旋蛋白，其對于對任何疾病的陽性預測值都較低［2］。本研究中，AC-6在PBC患者中檢出率為10.4%，位居第五，且AC-6陽性樣本中抗Sp100抗體檢出率為90.9%，而AC-7中該抗體檢出率僅25.0%。抗Sp100抗體對PBC診斷敏感性雖較低（20%～40%），但特異性高（＞95%）［9］，并且在AMA陰性PBC患者的診斷具有重要價值［10］。因此，臨床實驗室判讀核點型時，區分核多點與核少點對于ALD篩查具有重要意義。

本研究中，PBC患者中并未檢出AC-15，而AIH患者中AC-15檢出率僅1.5%。2例AC-15樣本中，1例ASMA陽性，2例抗F－肌動蛋白抗體均陽性，因此AC-15核型對ASMA有一定相關性。臨床實驗室對ALD篩查人群進行ANA核型判讀時，尤其需重視胞漿網狀／線粒體樣型、點狀核膜型、核多點型和胞漿線性／肌動蛋白型熒光核型，并在報告中給予必要的臨床建議。