漢族原發性膽汁性膽管炎患者抗線粒體抗體M2亞型抗原表位分布及其臨床價值*

邱方，諸萍，王嬋，江鵬，劉向東（1.南京醫科大學第四附屬醫院檢驗科，南京10031；.東南大學生命科學與技術學院，南京10096）

原發性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一種累及肝內膽管系統的慢性進行性自身免疫病，實驗室檢查常見血清堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性持續異常升高、抗線粒體抗體－M2（anti mitochondrial antibody-M2，AMA-M2）陽性，病理學檢查顯示肝臟內非化膿性膽汁淤積和小葉間膽管炎性損傷，只要符合兩點即可確 診［1-2］。熊 去 氧 膽 酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）是美國和歐洲肝病學會推薦的PBC治療唯一的一線藥物，能有效改善PBC的自然病史，但有約40%的患者對UDCA無藥物生化應答［1］。多個基于生化變量的預后預測量化模型已廣泛應用于PBC患者的風險分層管理，其中清蛋白（albumin，Alb）－膽紅素（bilirubin，TBil）評分（ALBI）是近年來被用于PBC預后預測的新模型，被證實與Mayo評分等主要預后評價標準及肝臟組織學有很好的相關性［3-4］。

AMA-M2陽性率在PBC中可達90%～95%，其靶抗原是線粒體內膜上的2－氧酸脫氫酶復合體（2-OADC），識別的抗原表位是2-OADC的主要組分丙酮酸脫氫酶復合體E2（PDC-E2）、支鏈二酮酸脫氫酶復合體E2（BCOADC-E2）和2－酮戊二酸脫氫酶復合體E2（OGDC-E2）［5］。國外學者曾對PBC患者上述抗原表位分布進行分析，但未進一步研究不同抗原表位的臨床價值，國內也未見此類報道。本研究擬分析374例漢族PBC患者PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2 3種AMA-M2抗原表位的分布情況，并探討其臨床價值。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取江蘇省PBC研究協作組建立的PBC生物樣本庫保存的2008年至2014年有完整臨床資料的漢族PBC患者血清標本374例（主要來自蘇州市第五人民醫院、無錫市第五人民醫院、鎮江市第三人民醫院、南京市第二醫院、東部戰區總醫院秦淮醫療區、常州第三人民醫院），其中男63例，女311例，年齡（55.6±11.8）歲。所有納入分析的患者均符合以下標準：（1）AMA-M2血清學檢測呈陽性；（2）生化膽汁淤積指標（如ALP和TBil）異常升高；（3）各類肝炎病毒感染指標陰性；（4）無血吸蟲感染史、藥物性肝炎史、酒精性肝炎病史。AMA-M2血清學檢測結果均經東南大學教育部發育與疾病相關基因重點實驗室建立的酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測驗證，該方法與商品化AMA-M2 ELISA試劑盒檢測結果比較符合率為98.3%［6］。其中，184例PBC患者有跨度在1年以上的多次臨床資料，可用于UDCA藥物生化應答情況的分析。

1.2 臨床資料收集 計算ALBI評分，公式：ALBI＝0.66×lg［TBil（μmol／L）］－0.085×［Alb（g／L）］。ALBI分級標準：1級，ALBI評分≤－2.60；2級，－2.60＜ALBI評分≤－1.39；3級，ALBI評分＞－1.39，1、2、3級PBC預后不佳的風險依次升高［3］。采用巴黎Ⅰ標準［2］對PBC患者進行UDCA生化應答分類，有生化應答的判斷標準如下：UDCA治療1年后，ALP≤3×正常上限（upper limit of normal，ULN），天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate transaminase，AST）≤2×ULN，TBil≤17.1μmol／L。

1.3 主要儀器與試劑 96孔酶聯板（Thermo公司），1575洗板機、iMark酶標儀（Bio-Rad公司），小牛血清（BSA，Sigma公司），辣根過氧化酶標記抗人IgG抗體（Millipore公司）。pET28a載體、GB05-Dir大腸埃希菌（東南大學教育部發育與疾病相關基因重點實驗室保存）。

1.4 PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2重組蛋白的制備 采用Red／ET重組技術制備PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2重組蛋白［6-7］。應用Primer Premier 3.0軟件設計含Red／ET重組同源臂的引物，引物序列見表1，由南京金斯瑞公司合成。以HepG2細胞cDNA為模板，用PCR技術擴增PDC-E2 cDNA（1 686 bp）、BCOADC-E2 cDNA（1 260 bp）和OGDC-E2 cDNA（1 161 bp）。采用Red／ET重組技術將擴增的cDNA與pET28a載體共同轉入GB05-Dir大腸埃希菌中，送南京金斯瑞公司進行Sanger法基因測序比對后，將正確的克隆導入大腸埃希菌BL21中大量誘導表達，獲得N端帶有6-His標簽的PDC-E2、BCOADC-E2和C端帶有6-His標簽的OGDC-E2重組蛋白。經Ni-NTA凝膠純化后，采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測鑒定。

表1 各抗原表位蛋白cDNA PCR擴增引物

1.5 ELISA方法的建立 分別以PDC-E2（100 ng）、BCOADC-E2（100 ng）和OGDC-E2（300 ng）為靶抗原，4℃過夜包被酶聯板，次日使用1575洗板機，用磷酸鹽吐溫緩沖液（PBST）洗板4次。用1%小牛血清（BSA）封閉酶聯板反應孔，室溫放置2 h后，用PBST洗板4次。待測樣本用1%BSA按1∶1 000稀釋，取100μL加入反應孔，經室溫溫育1 h后用PBST洗板5次。用1%BSA按1∶50 000稀釋辣根過氧化酶標記抗人IgG抗體，取100μL加入反應孔，經室溫溫育1 h后用PBST洗板5次，分別加入底物B（過氧化氫溶液）和底物A（四甲基聯苯胺溶液）各50μL，室溫放置20 min，加入終止液（H2SO4溶液）50μL，用iMark酶聯儀測定450 nm波長處吸光度值（A值）。結果判定：分別測定20例AMA-M2陰性的健康人血清，計算A均值和標準差（s），以A均值＋3s為cut-off值，大于cut-off值判定為有反應性。

1.6 統計學分析 用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計量資料中多組數據比較采用K-W檢驗，兩組間數據比較采用Mann-Whitney U檢驗；分類變量比較采用Pearson卡方檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2重組蛋白的鑒定 SDS-PAGE結果見圖1。

圖1 SDS-PAGE鑒定純化后3種AMA-M2抗原表位的重組蛋白

2.2 3種AMA-M2抗原表位與PBC患者血清反應性的分布情況 ELISA測定抗 PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2重組蛋白的cut-off值分別為0.332、0.359和0.257。374例PBC患者血清與PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2 3個抗原表位有反應性的比例分別為86.6%（324／374）、88.0%（329／374）和35.0%（131／374），有3例與3個抗原表位均無反應性，但其AMA-M2檢測結果為陽性。PBC患者血清對PDC-E2＋BCOADC-E2＋OGDC-E2、PDC-E2＋BCOADC-E2、PDC-E2、BCOADC-E2、PDC-E2＋OGDC-E2、BCOADC-E2＋OGDC-E2和OGDC-E2有反應性的例數分別為119、164、33、43、8、3和1例，PDC-E2＋BCOADC-E2＋OGDC-E2、PDC-E2＋BCOADC-E2、PDC-E2、BCOADC-E2是PBC患者血清有反應性的常見抗原表位反應模式，分別以A、B、C和D模式表示。

2.3 常見抗原表位反應模式間PBC患者ALBI分級結果的比較 根據ALBI公式計算PBC患者的評分結果，按照分級標準分為ALBI-1、2、3級。4種常見抗原表位反應模式間A模式ALBI-1患者比例低于C和D模式，ALBI-3級患者比例高于C和D模式，差異有統計學意義（χ2分別為14.174和14.167，P均＜0.05）。B模式ALBI-1級患者的比例低于C和D模式，差異有統計學意義（χ2分別為10.350和9.510，P均＜0.05）。見表2。

表2 常見抗原表位反應模式間PBC患者ALBI分級情況比較［n（%）］

2.4 UDCA生化應答和不應答患者間3種抗原表位分布比較 采用巴黎Ⅰ標準對有治療1年前后生化檢驗結果的184例患者進行UDCA藥物生化應答分類，應答和不應答患者各有95例和89例，藥物應答比例為51.6%。不應答患者血清與BCOADC-E2的反應率（89.9%）高于不應答者（77.9%），差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。C模式中不應答患者的比例高于A、B和D模式，差異有統計學意義（χ2分別為5.096、9.403和7.993，P均＜0.05），見表4。

表3 應答和不應答患者間抗原表位反應率比較

表4 常見抗原表位反應模式間應答和不應答患者分布比較［n（%）］

3 討論

上世紀60年代Walker等發現PBC患者血清中存在AMA，80年代Gershwin等發現并成功克隆AMA的抗原表位PDC-E2，90年代進一步確認BCOADC-E2和OOGDC-E2也是AMA的抗原表位［8］。

歐美學者采用免疫印跡法檢測PBC患者血清與PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2的反應率分別為81.7%、59.1%和27.4%［9］，與本研究結果的86.6%、88.0%和35.0%有一定的差異，尤其是BCOADC-E2。本研究采用的BCOADC-E2是全長片段，Leung等［10］認為AMA-M2的結合能力與BCOADC-E2肽段的長度呈正相關，這可能是導致結果差異的主要原因。PBC患者血清與3個抗原表位的反應模式共有7種，本研究結果表明漢族PBC患者以PDC-E2＋BCOADC-E2＋OGDC-E2（A模式）、PDC-E2＋BCOADC-E2（B模式）、PDC-E2（C模式）和BCOADC-E2（D模式）4種反應模式為主。分析抗原表位與PBC預后不佳的風險程度的關系表明，PBC預后不佳高風險級的ALBI-3級患者在A、B、C和D模式中的比例依次降低，其中A與C、D模式的差異均具有統計學意義，提示不同抗原表位對PBC預后的影響存在疊加效應，與PDC-E2、BCOADC-E2和OGDC-E2 3個抗原表位同時有反應性的PBC患者疾病預后不佳的風險較高。

本研究采用被美國肝病學會認為最簡單有效的巴黎Ⅰ標準對PBC患者UDCA生化應答進行分類［2］，并分析應答和不應答患者血清與3個AMA-M2抗原表位和常見抗原表位反應模式分布的差異，結果表明不應答患者對BCOADC-E2的反應率明顯高于應答組，但應答組的陽性率也高達77.9%。本研究結果還顯示僅與BCOADC-E2有反應的UDCA應答PBC患者比例是不應答患者的2倍，僅與PDC-E2有反應的不應答患者比例則遠高于應答患者，而與3個或2個抗原表位同時有反應性的應答和不應答患者的比例相差卻不明顯。提示BCOADC-E2和PDC-E2抗原表位可能與UDCA應答相關，但可能存在交互作用。在今后的研究中需要通過定量方法確定2類患者血清與BCOADC-E2和PDC-E2反應強度的差異，并跟蹤其反應強度及肝功能生化指標的動態變化，分析其與UDCA療效的相關性。