抗組蛋白H2 A抗體間接ELISA法的建立和臨床初步應用*

王海永，徐敏，李曉軍（1.南京中醫藥大學附屬醫院檢驗科，南京1000；.東部戰區總醫院中心實驗科，南京1000）

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性的、炎癥性的自身免疫性疾病［1］，病因復雜，發病機制尚不清楚。目前，多項研究證實RA患者體內存在針對瓜氨酸化組蛋白的自身抗體［2-3］以及針對天然組蛋白的自身抗體［4-5］，提示組蛋白可能與RA的發生與發展有關。本課題組前期利用質譜和生物信息學分析技術，對RA患者關節滑膜組織中的蛋白質進行鑒定和分析發現組蛋白H2A在RA患者滑膜組織中有差異性表達［6］。為進一步驗證質譜鑒定的結果，本研究通過在大腸埃希菌中原核表達并純化組蛋白H2A，以H2A作為靶抗原，建立檢測血清中抗H2A抗體的間接ELISA技術，比較分析RA患者和健康人對照血清中的抗H2A抗體水平。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集自2016年2月至2017年1月東部戰區總醫院的門診和住院RA患者共50例，其中男性13例，女性37例，年齡（47.4±16.8）歲，納入條件符合2010年美國風濕病學學會／歐洲抗風濕病聯盟（ACR／EULAR）的診斷標準［7］，排除合并嚴重內外科疾病以及其他自身免疫病如系統性紅斑狼瘡、多發性硬化癥以及干燥綜合征的病例。健康人對照50例，來自本院體檢健康者，男性13例，女性37例，年齡（38.6±12.3）歲，排除有明顯自身免疫傾向的健康者。抽取研究對象早晨空腹靜脈血3～5 mL，3 500 r／min離心5 min分離血清，血清貯存于－70℃凍存備用，無脂血、溶血等情況。

1.2 菌株、載體、主要試劑和儀器 表達宿主菌BL21（DE3）（北京TransGen生物技術公司），表達載體pET28a（東部戰區總醫院中心實驗室保存），PCR引物（美國Invitrogen公司），限制性內切酶Eco RⅠ、NdeⅠ、Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、PCR反應緩沖液和核酸標準相對分子質量（大連TakaRa公司），質粒抽提純化試劑盒及DNA凝膠電泳回收試劑盒（美國Axygen公司），異丙基硫代半乳糖苷（IPTG，德國Merck公司），Ni-resin（德國Novagen公司），BCA蛋白質定量試劑盒（上海碧云天公司），抗H2A抗體陽性血清、HRP－抗人IgG（美國Sigma公司），PTC-200 PCR基因擴增儀（美國MJResearch公司），酶聯儀、蛋白質電泳儀（美國Bio-Rad公司），超聲粉碎儀（美國Sonics公司）。

1.3 引物設計與合成 根據H2A基因cds序列和pET28a表達載體的MCS位點，設計特異性PCR引物，用于擴增H2A基因，H2A-F1：5′-TTCCATATGTC TGGACGTGGCAAGCAGGGA-3′，H2A-R1：5′-CCGG AATTCTTACTTGCCCTTCGCCTTGTGGT-3′；其 中H2A-F1中含有NdeⅠ酶切位點；H2A-R1中含有Eco RⅠ酶切位點。

1.4 H2A／pET28a重組質粒的構建 RT-PCR擴增H2A基因，利用限制性內切酶Eco RⅠ／NdeⅠ同時雙酶切PCR產物和pET28a表達載體，目的片段經T4 DNA連接酶連接后轉化BL21（DE3）感受態細胞，挑取單菌落，抽提質粒，測序驗證，驗證正確的重組質粒命名為H2A／pET28a。

1.5 組蛋白H2A的原核表達及純化 利用IPTG誘導融合蛋白的表達，完畢后收集菌體，超聲波破碎，離心并分別收集上清液和沉淀，SDS-PAGE鑒定蛋白質表達情況。確定蛋白質正確表達后，純化H2A重組蛋白。SDS-PAGE檢測蛋白質純度，BCA蛋白質定量試劑盒測定蛋白質濃度。

1.6 重組蛋白的western blot鑒定 將純化的重組蛋白H2A經SDS-PAGE后轉PVDF膜，50 g／L脫脂奶粉4℃封閉過夜，用抗核抗體檢查中抗組蛋白抗體陽性血清及HRP－抗人IgG分別作為第一抗體、第二抗體進行溫育，加入化學發光試劑進行顯色反應。

1.7 間接ELISA法的建立 以純化的H2A蛋白為包被抗原，HRP－抗人IgG為二抗，建立檢測抗H2A抗體的間接ELISA方法。用棋盤滴定法確定間接ELISA的最佳包被濃度（10、5、2.5、1μg／mL），最佳血清稀釋度（1∶100、1∶200、1∶400、1∶800），最佳二抗稀釋度（1∶5 000、1∶10 000、1∶20 000、1∶40 000）。（1）包被：將H2A用包被緩沖液稀釋至5μg／mL，包被聚乙烯ELISA板，每孔100μL，置4℃過夜，用PBST洗板3次，每次3 min，拍干；（2）封閉：每孔加100μL用PBST稀釋的50 g／L脫脂奶粉封閉，置于4℃過夜，用PBST洗板3次，每次3 min，拍干；（3）加血清樣本：將RA組、健康人對照組、陽性對照和陰性對照血清按1∶400稀釋，每個樣本重復3孔，每孔加入100μL，置37℃反應1 h，洗板3次，每次3 min，拍干；（4）加二抗：將HRP－抗人IgG按1∶20 000稀釋，每孔加入100μL，置37℃反應1 h，洗板5次，每次3 min，拍干；（5）顯色與終止：加顯色液A和顯色液B，室溫避光反應10 min，加終止液終止反應；（6）讀板：酶聯儀檢測A450nm值。

1.8 統計學分析 采用GraphPad Prism 6軟件進行統計學分析。RA患者與健康人對照組數值用均數±標準差表示，比較采用獨立樣本t檢驗。率的比較用卡方檢驗。以P＜0.05為有統計學意義。繪制ROC曲線，用ROC曲線下面積（AUCROC）評估抗H2A抗體作為診斷指標的潛力。

2 結果

2.1 重組質粒H2A／pET28a的鑒定 經PCR擴增、限制性酶切、DNA連接、轉化、克隆鑒定等步驟，成功構建重組質粒H2A／pET28a，圖1為重組質粒 H2A／pET28a的DNA測序結果。

圖1 重組質粒H2 A／pET28a的DNA測序結果

2.2 重組蛋白的原核表達與純化 原核表達質粒H2A／pET28a體外誘導表達后經SDS-PAGE檢測分析，結果顯示，在相對分子量15 000處有預期大小的蛋白質條帶，且該條帶在上清液和沉淀中都有表達，結果見圖2（1～5）。進一步利用His標簽蛋白純化試劑盒對H2A重組蛋白進行純化，SDS-PAGE結果顯示，在相對分子量15 000處有單一條帶，灰度分析顯示蛋白質純度大于90%，結果見圖2（6～8泳道）。

圖2 重組H2A蛋白的表達與純化

2.3 重組蛋白的western blot鑒定 用抗組蛋白抗體陽性血清鑒定純化的重組H2A蛋白，western blot結果顯示，在相對分子量15 000處有一條清晰的條帶，見圖3。

圖3 重組H 2A蛋白的western blot鑒定

2.4 間接ELISA反應條件的優化 用棋盤滴定法對實驗條件進行優化。選擇強陽性血清的A值在1.0左右、陰性血清的A值小于0.1的條件作為最適條件，結果顯示，H2A蛋白最佳包被濃度為5μg／mL，待測血清最佳稀釋度為1∶400，HRP－抗人IgG最佳稀釋度為1∶20 000。

2.5 特異性考察 方法特異性考察采用抗體阻斷試驗。選擇抗H2A抗體強陽性的血清作1∶400稀釋，并加入H2A抗原至終濃度分別為0、0.5、1、2μg／mL，37℃溫育1 h后，12 000 r／min離心10 min，取上清液進行抗H2A抗體檢測。結果顯示，經H2A吸收過的強陽性血清，其A值隨加入的H2A量的增加而降低，當H2A的終濃度達到2μg／mL時，A值從1.207降低至0.405，阻斷率為66.4%，見圖4。

圖4 特異性阻斷抑制試驗

2.6 重復性試驗 批內重復性試驗：使用同一批次純化的H2A蛋白包被酶聯板，對10份高、中、低3個濃度的抗H2A抗體樣本進行檢測，每個樣本重復3孔。批間重復性試驗：使用3個批次純化的H2A蛋白包被酶聯板，檢測同樣的10份血清樣本。計算批內和批間變異系數。結果顯示，批內變異系數分別為5.1%、7.5%和6.6%，批間變異系數分別為7.7%，9.5%和8.4%，均小于10%，表明該方法重復性較好。

2.7 抗H2A抗體用于RA診斷的效果 按照優化的反應條件對50份RA組和50份健康人對照組血清進行測定，以不同的A值制作ROC曲線，計算ROC曲線下面積（AUCROC）?？笻2A抗體診斷RA的AUCROC為0.884，標準誤為0.030，P＜0.01，95%可信區間為0.819～0.948。當A＝0.494時，敏感性為84%，特異性為80%，敏感性、特異性最高，故以0.494為cut-off值。

2.8 臨床樣本檢測 用建立的間接ELISA方法測定50份RA組和50份健康人對照組血清，結果顯示，50例RA患者血清的A值為0.930±0.546，50例健康人對照組血清的A值為0.367±0.203，RA患者血清抗H2A抗體水平明顯高于健康人對照組，差異有統計學意義（t＝6.834，P＜0.01）。該法測得RA患者血清抗H2A抗體的陽性率為84%（42／50），明顯高于健康人對照組20%（10／50），差異有統計學意義（χ2＝41.026，P＜0.01）。

3 討論

2010年ACR／EULAR將類風濕因子（RF）和抗瓜氨酸化肽抗體（ACPA）納入RA的分類標準中，但是RF的特異性較差，還可見于其他的風濕性疾病、慢性炎癥患者以及老年人中［8］；ACPA對RA診斷具有較高的特異性，但是仍有約20%的漏診率。因此，對RA相關生物標志物的研究仍很需要。本研究基于質譜發現，挑選差異蛋白H2A進行驗證，探索抗H2A抗體與RA的關系。

本研究構建了含有His標簽的H2A／pET28a原核表達載體，以便對重組蛋白進行純化，純化的H2A蛋白經western blot鑒定具有良好的反應原性。因此，本實驗利用純化的H2A蛋白作為包被抗原，通過對抗原濃度、血清及酶標二抗稀釋度等條件進行優化，建立檢測抗H2A抗體的間接ELISA方法。方法學特性驗證結果顯示，該方法的特異性和重復性均滿足臨床實驗室的要求；對臨床樣本進行檢測發現，RA患者血清抗H2A的敏感性為84%（42／50），特異性為80%（40／50），RA組血清抗H2A抗體的陽性率明顯高于健康人對照組，表明可以用間接ELISA檢測RA患者血清中抗H2A抗體的水平。由于每次復性的重組蛋白在重復性和穩定性上可能略有差異，以及市場上沒有商品化的診斷試劑盒可供參考，這可能會導致建立的ELISA方法存在一定局限性，所以后續仍需進一步擴大樣本量，完善優化部分指標，以期獲得更為可靠的應用數據。

綜上，本研究利用原核表達系統體外表達了重組H2A蛋白，并且建立了檢測血清抗H2A抗體的間接ELISA方法，并在臨床樣本中作初步驗證，為后續相關研究提供了依據。