黃地安消膠囊調控IRS-1/PI3K/Akt/GSK-3β信號通路改善HepG2細胞胰島素抵抗*

高家榮，郭明飛，單 莉，魏良兵

[1.安徽中醫藥大學第一附屬醫院(國家中醫藥管理局中藥制劑三級實驗室)，安徽合肥 230012 ；2. 安徽醫科大學第四附屬醫院]

T2DM是引起高血壓、高血糖、胰島素抵抗等一系列代謝綜合征的常見病理基礎[1-2]。肝臟是生物代謝的主要器官，對物質的合成、分泌、代謝和排泄起著至關重要的作用[3]。胰島素抵抗(insulin resistance,IR)作為2型糖尿病發病中的核心病理生理機制一直是研究的熱點，胰島素抵抗是胰島素作用的靶器官(主要是肝臟、骨骼肌和脂肪組織等)對胰島素作用的敏感性降低而致血糖含量升高的病理狀態[4]。當肝部分胰島素抵抗時，容易導致肝糖原合成受阻，糖代謝功能紊亂[5-6]。因此，增強胰島素敏感性、降低血糖水平和改善胰島素抵抗是治療T2DM的關鍵。黃地安消膠囊為安徽中醫藥大學第一附屬醫院治療糖尿病的特色醫院制劑，臨床應用多年，療效確切[7-8]，但其對改善胰島素抵抗的分子機制尚不明確。本文以高糖高胰島素為誘導條件，探究黃地安消膠囊改善HepG2細胞胰島素抵抗的分子機制。

1 材料與方法

1.1試驗藥物 黃地安消膠囊處方由麥冬，枇杷葉，三七，葛根等六味中藥組成，按組方比例稱取適量藥材，第一次加入十倍量的水加熱回流提取1.5 h，第二次加8倍量的水加熱回流提取1 h，合并兩次濾液，靜止24 h后，過濾，濾液濃縮干燥，制成干浸膏樣品，動物灌胃給藥時備用。

1.2實驗動物 SPF級雄性SD大鼠，體質量(200.0±10.0)g，購自安徽醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK(皖)2011-002。所有實驗動物均飼養于安徽中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物房，每籠5只，光照和黑暗各12 h交替循環。

1.3試劑 高糖DMEM培養基(Gibco公司)，胎牛血清(FBS，Hyclone公司)，二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，四甲基噻唑藍(MTT，Solarbio公司)，0.25 %胰蛋白酶(Amresco公司)，Trizol試劑(上海生工生物技術公司)，甲醇(上海國藥化學試劑有限公司)

1.4儀器 MCO-15AC CO2恒溫培養箱(SANYO公司)；潔凈工作臺(蘇凈安泰)；Neofuge 15R離心機(Heal Force公司);Theymo Forma 381型CO2培養箱(美國);Nikon Eclipse C1熒光顯微鏡(日本)；Nikon DS-U3成像系統(日本)；BioTek 酶標儀(德國)

1.5方法

1.5.1含藥血清制備 大鼠適應性飼養1周后，隨機分為對照組和黃地安消膠囊組，每組各10只。黃地安消膠囊組按照10 g/kg劑量灌胃給藥，2次/d。對照組給予等量溶媒。給藥周期為3 d，第3 d一次給予全天劑量后1 h，按照2 mL/kg劑量腹腔注射給予水合氯醛進行麻醉，經腹主動脈取血。靜止2 h后，4 000 r/min離心15 min，分離血清，放置于56 ℃水浴鍋中滅菌30 min，經0.22 μm微孔濾膜過濾，分裝，儲存于-20 ℃冰箱備用。

1.5.2細胞培養和胰島素抵抗模型建立 將HepG2細胞培養在含10 %滅活胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養基中，置于37 ℃，5 %CO2的培養箱中，取對數期的細胞接種于96孔板中，待細胞長至80 %～90 %融合后用于實驗。在空白孔中加入無血清DMEM培養液，其余各孔中加入30 mmol/L濃度的高糖溶液，之后在100 mg/L胰島素中孵育24 h。

1.5.3MTT法測定HepG2的抑制作用 取對數生長期的細胞，用0.25 %胰蛋白酶消化后，用含有10 %胎牛血清的高糖DMEM培養液將細胞混懸，稀釋至8 ×104/mL，接種于96孔培養板，200 μL/孔。細胞貼壁生長后棄培養液，分別加入5 %、10 %、15 %、20 %、25 %、30 %的含藥血清和10 %胎牛血清的高糖DMEM培養液，調零孔中不加細胞，只加入200 μl完整培養液。常規培養24 h、48 h后，每孔加入濃度為5 g/L的MTT溶液20 μL，繼續培養4 h后，吸取孔中廢液，加入DMSO 150 μL/孔，低速振蕩10 min，酶標儀490 nm波長測定每個孔的吸光度A。細胞生長抑制率=(1-A給藥組/A對照組)×100 %。

1.5.4免疫熒光分析 含藥血清處理HepG2細胞24 h，然后將細胞固定在的4 %多聚甲醛/PBS中15 min，浸泡在0.5 %Triton X-100/PBS中20 min，用PBS洗滌3次，用3 %胎牛血清白蛋白(BSA)在PBS中封閉30 min，滴加一抗IRS-1(1∶150)、PI3K(1∶200)、p-Akt(1∶200)、p-GSK-3β(1∶100)，4 ℃孵育過夜后將細胞在PBS中洗滌，然后滴加二抗(1∶500)在37℃下孵育1 h，用DAPI復染細胞核，在熒光顯微鏡下觀察細胞。

1.5.5HepG2細胞IRS-1、PI3K、Akt、GSK-3β mRNA的表達 采用Trizol試劑提取HepG2細胞總RNA，經逆轉錄酶反轉錄成cDNA。各引物序列見表1。擴增條件：95 ℃處理10 min，(95 ℃，變性60 s，60 ℃退火延伸30 s)×40個循環。采用相對定量法分析，結果以2-ΔΔCT表示。

1.5.6HepG2細胞p-IRS-1、PI3K、p-Akt、p-GSK-3β蛋白的表達 HepG2細胞在PIPA緩沖液中溶解，細胞裂解液后10 000 r/min離心10 min，收集上清液并煮沸5 min，然后用SDS-PAGE分離蛋白，凝膠電泳后轉移到PVDF膜，封閉后滴加一抗p-IRS-1(1∶500)、PI3K(1∶1 000)、p-AKT(1∶5 000)、p-GSK-3β(1∶5 000)和β-actin(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜，滴加二抗(1∶1 000)在室溫下孵育1 h，使用HRP-ECL發光法進行鑒定，并用凝膠成像系統進行分析。

2 結果

2.1含藥血清對HepG2細胞增殖的影響 隨著血清濃度的增加，抑制率(IR)也升高。細胞代謝和增殖與血清濃度和培養時間呈正相關。當血清濃度超過10 %時，細胞代謝受到明顯抑制，出現細胞死亡。比較培養時間、血清濃度和細胞代謝活性的影響，最終將10 %含藥血清和培養48 h作為后續實驗濃度。見表2。

表2 含藥血清對OD和IR的影響

2.2黃地安消膠囊對HepG2細胞IRS-1表達的影響 免疫熒光結果分析表明，p-IRS-1主要在細胞膜上表達，正常細胞中目標蛋白表達明顯(圖1A，B)。與正常組(Control)相比，模型組(Model)IRS-1 mRNA和p-IRS-1蛋白表達降低；與模型組相比，含藥血清組(HDAXC)IRS-1 mRNA和p-IRS-1蛋白表達升高(P<0.05，圖1C，1D，1E)。

圖1 含藥血清對HepG2細胞IRS-1表達的影響

2.3黃地安消膠囊對HepG2細胞PI3K表達的影響 免疫熒光染色結果表明，與正常組相比，模型組PI3K蛋白表達降低(圖2A，2B)；與模型組比較，含藥血清組PI3K mRNA和蛋白表達均具有增加趨勢，差異具有統計學意義(P<0.05，圖2C，2D，2E)。

圖2 黃地安消膠囊對HepG2細胞PI3K表達的影響

2.4黃地安消膠囊對HepG2細胞Akt表達的影響 免疫熒光分析顯示，p-Akt表達主要在細胞膜上，在模型組中表達含量較低(圖3A，3B)。與正常組相比，模型組Akt mRNA和p-Akt蛋白表達降低，與模型組相比，含藥血清組Akt mRNA和p-Akt蛋白表達升高(P<0.05，圖3C，3D，3E)。

2.5黃地安消膠囊對HepG2細胞GSK-3β表達的影響 免疫熒光結果表明p-GSK-3β主要在模型組表達較高(圖4A，4B)。與正常組相比，模型組GSK-3β mRNA表達的水平增加，與模型組相比，含藥血清組GSK-3β mRNA表達水平降低；與正常組相比，模型組p-GSK-3β蛋白表達增加，與模型組相比，含藥血清組p-GSK-3β蛋白表達降低(P<0.05，圖3C，3D，3E)。

圖4 黃地安消膠囊對HepG2細胞GSK-3β表達的影響

3 討論

肝臟是葡萄糖輸出和糖原合成的主要部位，肝臟胰島素抵抗易引起高胰島素血癥、糖原合成障礙、脂肪肝以及T2DM等癥狀產生[9-10]。因此，改善肝臟胰島素抵抗已成為治療T2DM等代謝綜合征的關鍵途徑[11]。

正常生理條件下，胰島素經分泌入血后，與肝細胞膜上的特定受體結合，沿著IRS-1/PI3K/Akt/GSK-3β信號通路發生級聯反應，起著調節血糖穩態的作用[12]。在這一傳遞過程中，胰島素首先與肝細胞膜上胰島素受體α亞單位結合，通過激活內源性酪氨酸激酶產生磷酸化效應從而激活β亞單位的活性。胰島素受體的激活會對IRS-1和PI3K的酪氨酸殘基位點磷酸化進行催化[13-14]。在胰島素抵抗大鼠的肝臟組織中，IRS-1蛋白表達降低，引起肝糖原合成減少，糖異生作用增加，葡萄糖含量升高[15]。通過對C57BL/ksJ-db/db小鼠建立胰島素抵抗模型發現，經藥物治療后，給藥組小鼠IRS-1、PI3K和Akt的表達明顯增加，同時肝臟葡萄糖攝取和糖原合成亦具有增加趨勢[16]。PI3K/Akt作為胰島素傳遞的下游靶點在這一過程中起著至關重要的作用。肝臟中PI3K和Akt蛋白表達水平的上調和PI3K/Akt通路的激活可抑制下游GSK-3β磷酸化的表達，降低GSK-3β活性和表達降低，從而促進GSK-3β蛋白底物GS去磷酸化和過表達[17-18]。GSK-3β受PI3K和AKT的調控，激活的PI3K/Akt可以降低GSK-3β的表達，當PI3K/Akt蛋白的表達降低時，這種現象可以逆轉。抑制GSK-3β去磷酸化可增加肝臟中GS的活化和糖原合成[19]。在HepG2細胞模型組中，我們觀察到IRS-1、PI3K、Akt的表達降低，GSK-3β的表達增加。上述實驗結果均與本實驗結果相一致，表明黃地安消膠囊能夠增強HepG2細胞的胰島素信號通路活性，增加葡萄糖攝取，降低血糖水平，緩解糖尿病癥狀。

綜上所述，黃地安消膠囊能夠通過調控IRS-1/PI3K/Akt/GSK-3β介導的胰島素信號通路的激活，提高胰島素信號的傳導，促進糖原合成，降低血糖。其結果表明黃地安消膠囊對胰島素信號通路的傳遞具有促進作用，其機制可能與其調控IRS-1/PI3K/Akt/GSK-3β信號通路蛋白活性有關。