miR-122a對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2化療藥物敏感性的影響及其機(jī)制研究*

郝曉娜，朱茂信，劉 微，閔思敏，薛曉宇，張英杰

(蚌埠醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，安徽蚌埠 233030)

原發(fā)性肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種常見(jiàn)的威脅人類健康的惡性腫瘤，我國(guó)是受其危害最嚴(yán)重的國(guó)家之一，發(fā)病率和死亡率約占全球的50.0 %[1]。肝癌以手術(shù)治療為主，放射治療和化學(xué)藥物治療為輔。但對(duì)于術(shù)后、晚期肝癌和復(fù)發(fā)患者，化療仍是肝癌治療的重要手段之一。目前，臨床上常用的藥物有順鉑、5-氟尿嘧啶、絲裂霉素等，但有部分患者在治療中會(huì)出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。如何降低肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的耐藥、提高化療療效是我們目前亟待解決的問(wèn)題。miRNA是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA，長(zhǎng)度約19～25個(gè)核苷酸。隨著對(duì)miRNA研究的深入，發(fā)現(xiàn)miR-122具有肝臟特異性，成年個(gè)體肝臟中總miRNA的70.0 %是miR-122[2]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-122在肝癌的發(fā)生、發(fā)展中起者重要作用，其在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)顯著下調(diào)[3-5]。因此，本研究旨在觀察過(guò)表達(dá)miR-122的肝癌細(xì)胞株HepG2對(duì)化療藥物的敏感性，并闡明部分機(jī)制，為肝癌的發(fā)病機(jī)制研究和治療方法提供新思路和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞株為人肝癌細(xì)胞系HepG2，由蚌埠醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心保存?zhèn)溆谩Ｖ饕噭┌―MEM培養(yǎng)液(Invitrogen 公司)，10.0 %胎牛血清(杭州四季青)，胰蛋白酶(寶泰克生物技術(shù)有限公司)，PBS緩沖液(自制)，過(guò)表達(dá)miR-122和綠色熒光蛋白(GFP)基因的慢病毒(human miR-122a Virus)及空載病毒(LV3-NC Virus)，由上海吉瑪基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成，逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒、real-time PCR試劑盒購(gòu)于大連TaKaRa公司，Annexin V-PE/7-AAD凋亡流式試劑盒(Solarbio)、Bcl-2和p53單抗(Bioworld Technology)。

1.2方法

1.2.1LV3-human miRNA-122a mimics慢病毒過(guò)表達(dá)載體的制備 根據(jù)Pubmed提供的人miR-122a基因序列篩選和構(gòu)建LV3-human miRNA-122a質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用EcoRI進(jìn)行單酶切鑒定并進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)miR-122a慢病毒過(guò)表達(dá)載體過(guò)表達(dá)成功后進(jìn)行慢病毒大規(guī)模包裝與滴定，從而成功制備綠色熒光蛋白(GFP)基因和過(guò)表達(dá)miR-122a的慢病毒(human miR-122a Virus)及空載病毒(LV3-NC Virus)。

1.2.2過(guò)表達(dá)miR-122a-HepG2體系的建立 按照吉瑪基因重組慢病毒操作手冊(cè)，選取不同的病毒感染復(fù)數(shù)(MOI值)1、20、50、100進(jìn)行感染預(yù)實(shí)驗(yàn)，熒光顯微鏡下觀察感染效率，最終MOI值為20。將一定數(shù)量的狀態(tài)良好的HepG2接種于24孔板，37 ℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜后按照產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行感染操作：加入慢病毒或空病毒感染細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；24 h后吸去病毒稀釋液，換入500 μL新鮮培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；48 h后通過(guò)熒光顯微鏡觀察慢病毒轉(zhuǎn)染情況。

1.2.3實(shí)驗(yàn)分組 本實(shí)驗(yàn)分3個(gè)組：腫瘤細(xì)胞組(HepG2細(xì)胞)、空載病毒組(空載病毒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞)、miR-122a腫瘤細(xì)胞組(過(guò)表達(dá)miR-122a的HepG2細(xì)胞)。

1.2.4HepG2中miR-122a表達(dá)水平的檢測(cè) HepG2細(xì)胞提取總RNA，按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書操作反轉(zhuǎn)錄成cDNA，從miRNA庫(kù)中查找miR-122a的序列，設(shè)計(jì)并合成引物(表1)，在PCR反應(yīng)板中按說(shuō)明書加入各試劑進(jìn)行Real-time PCR反應(yīng)。所得結(jié)果利用2-ΔΔCT方法計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列表

1.2.5細(xì)胞存活率的檢測(cè) (1)不同濃度的順鉑對(duì)HepG2細(xì)胞存活率影響：HepG2細(xì)胞接種于96孔板(5 000個(gè)/孔)，分別加入不同濃度順鉑，使終濃度為1.5 μg/mL、3 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL，24 h后細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn)(CCK-8實(shí)驗(yàn))，測(cè)定每孔的吸光度，并計(jì)數(shù)HepG2細(xì)胞的存活率，細(xì)胞的存活率=(藥物組A值/對(duì)照組A值)×100 %，并選取合適的濃度做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)miR-122a上調(diào)對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響：腫瘤細(xì)胞組和miR-122a腫瘤細(xì)胞組的細(xì)胞接種于96孔板(5 000個(gè)/孔)，加入終濃度為1.5 μg/mL和3 μg/mL的順鉑，24 h后細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn)(CCK-8實(shí)驗(yàn))，測(cè)定每孔的吸光度，并計(jì)數(shù)HepG2細(xì)胞的存活率。

1.2.6miR-122a上調(diào)對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡率的影響 腫瘤細(xì)胞組和miR-122a腫瘤細(xì)胞組的細(xì)胞接種于6孔板中，加入終濃度為1.5 μg/mL和3 μg/mL的順鉑，24 h后Annexin V-PE/7-AAD雙染法分別檢查兩組細(xì)胞的凋亡率，并進(jìn)行比較，并挑選本實(shí)驗(yàn)最佳藥物濃度。

1.2.7Western blot法檢測(cè)Bcl-2和P53蛋白 收集3 μg/mL的順鉑作用前后的腫瘤細(xì)胞組和miR-122a腫瘤細(xì)胞組的細(xì)胞，加入150 μL蛋白裂解液裂解30 min，再經(jīng)4 ℃、12 000 r/min離心10 min,取上清，BCA法蛋白定量。加入上樣緩沖液，重組15 min。每孔加入20 μL總蛋白上樣，進(jìn)行SDS-PAGE(8.0 %分離膠,5.0 %濃縮膠)電泳,電壓90 V,待溴酚藍(lán)電泳達(dá)凝膠底部時(shí)將凝膠中的蛋白質(zhì)濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜(PVDF)上。采用麗春紅S染膜、考馬斯亮藍(lán)染膠,通過(guò)與蛋白Marker比較,確定目的條帶位置。再將PVDF膜置于含5.0 %脫脂奶粉的TBST中,室溫下?lián)u床輕搖2 h進(jìn)行封閉。加入大鼠抗bcl-2(1∶500)和P53(1∶500)單抗，4 ℃孵育過(guò)夜，繼以相匹配的辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗(1∶1 000)室溫孵育1 h，TBST充分洗膜。ECL顯色,暗室曝光,凝膠成像系統(tǒng)掃描成像。進(jìn)行組間比較，探究miR-122a上調(diào)對(duì)提高HepG2細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的分子機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1POP慢病毒過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建及慢病毒包裝 篩選和構(gòu)建慢病毒miR-122a過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用EcoRI進(jìn)行單酶切鑒定，酶切結(jié)果表明，被EcoRI切開(kāi)的可能是陽(yáng)性克隆(圖1A)。將克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定、測(cè)序驗(yàn)證(圖1B)后，進(jìn)行慢病毒包裝與滴定。

圖1 miR-122a過(guò)表達(dá)載體鑒定

2.2過(guò)表達(dá)miR-122a-HepG2體系的建立 轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡可觀察到過(guò)表達(dá)miR-122a慢病毒組和空載病毒體組的HepG2中有GFP表達(dá)，48 h后表達(dá)量最高(圖2)，之后隨著細(xì)胞凋亡增加表達(dá)率降低。

圖2 過(guò)表達(dá)miR-122a慢病毒轉(zhuǎn)染HepG2情況(×100)

2.3RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染后目的基因表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡下觀察慢病毒轉(zhuǎn)染情況,確定帶有熒光后，各組的HepG2，提取總RNA，RT-PCR檢測(cè)miR-122a表達(dá)情況顯示，如圖3所示：轉(zhuǎn)染miR-122a mimic后可增加肝癌HepG2細(xì)胞內(nèi)miR-122a的表達(dá)水平為正常HepG2組和空病毒組的15～16倍(P<0.0001)。

圖3 各組HepG2細(xì)胞miR-122a相對(duì)表達(dá)量

2.4不同濃度的順鉑對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響 我們選取了5個(gè)濃度梯度的順鉑，采用細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn)(CCK-8實(shí)驗(yàn))明確順鉑對(duì)HepG2細(xì)胞增殖抑制的情況。結(jié)果顯示，當(dāng)順鉑濃度大于3 μg/mL時(shí)(存活率79.21±1.87 %)，HepG2細(xì)胞增殖開(kāi)始明顯下降，與1.5 μg/mL順鉑組(存活率97.32±1.45 %)和5 μg/mL順鉑組(存活率51.54±3.46 %)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，圖4。為了明確過(guò)表達(dá)miR-122是否可提高HepG2對(duì)化療藥物的敏感性，我們選擇低濃度順鉑即1.5 μg/mL和3 μg/mL進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖4 不同濃度的順鉑HepG2細(xì)胞存活率

2.5miR-122a上調(diào)對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響 CCK-8實(shí)驗(yàn)所示：相同濃度的順鉑1.5 μg/mL和3 μg/mL，miR-122a腫瘤細(xì)胞組細(xì)胞的存活率[(95.31±2.02)%和(71.56±3.44)%]低于腫瘤細(xì)胞組細(xì)胞的存活率[(97.32±1.45)%和(79.21±1.87)%](P<0.05)，提示過(guò)表達(dá)miR-122a可提高HepG2對(duì)化療藥物的敏感性。見(jiàn)圖5。

圖5 相同濃度的順鉑miR-122a過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

2.6miR-122a上調(diào)對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡率的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)順鉑1.5 μg/mL時(shí)，腫瘤細(xì)胞組24 h細(xì)胞的凋亡率為(4.86±0.34)%(圖6A)，miR-122a腫瘤細(xì)胞組24 h凋亡率(8.02±0.24)%(圖6B)；當(dāng)順鉑3 μg/mL時(shí)，腫瘤細(xì)胞組24 h細(xì)胞的凋亡率為(34.23±3.56)%(圖6C)，miR-122a腫瘤細(xì)胞組24 h凋亡率(41.98±4.21)%(圖6D)。提示過(guò)表達(dá)miR-122a后能明顯提高HepG2在順鉑溶液中的凋亡率(P<0.05)，且順鉑濃度3 μg/mL更明顯。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率

2.7Western blot法檢測(cè)Bcl-2和P53蛋白 腫瘤細(xì)胞組和miR-122a腫瘤細(xì)胞組的細(xì)胞，置于順鉑濃度3 μg/mL的培養(yǎng)環(huán)境中，培24 h后，Western blot分析各組細(xì)胞bcl-2和p53蛋白的表達(dá)情況(圖7A和圖7B)。miR-122a腫瘤細(xì)胞組bcl-2吸光度比值為(0.324±0.043)，與腫瘤細(xì)胞組bcl-2吸光度比值(0.762±0.132)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；miR-122a腫瘤細(xì)胞組P53吸光度比值為(0.892±0.153)，與腫瘤細(xì)胞組p53吸光度比值(0.82±0.085)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖7A 各組細(xì)胞bcl-2蛋白的表達(dá) 圖7B 各組細(xì)胞P53蛋白的表達(dá)

3 討論

肝癌是嚴(yán)重威脅我國(guó)人民健康的惡性肺瘤之一，其發(fā)病率及死亡率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。盡管肝癌手術(shù)切除的技巧及方法不斷進(jìn)步，不斷有肝癌靶向治療藥物問(wèn)世，但肝癌的總體療效仍難以令人滿意。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，人類有超過(guò)60.0 %的蛋白編碼基因受miRNA的選擇性調(diào)控[6]。miRNAs與腫瘤相關(guān)性的研究已成為近年來(lái)腫瘤研究領(lǐng)域中的一個(gè)熱點(diǎn)，大約50.0 %得到注解的miRNAs在基因組上定位于與腫瘤相關(guān)的脆性位點(diǎn)(fragile site)。這說(shuō)明miRNAs在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起至關(guān)重要的作用，這些miRNAs所起的作用類似于抑癌基因和癌基因的功能，具有特異性的腫瘤組織表達(dá)譜。隨著對(duì)miRNA研究的深入，發(fā)現(xiàn)許多miRNA在HCC的形成和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，并找到多個(gè)治療靶點(diǎn)[7-9]。多項(xiàng)研究表明，miR-122與HCC的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切[10]，它具有肝臟特異性，在每個(gè)正常肝細(xì)胞中有約66 000個(gè)拷貝，是肝臟中最豐富的miRNA，占肝臟miRNA總量的70.0 %，其在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)下調(diào)[11]，并證實(shí)miR-122在肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中有重要作用[12-13]。

因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)慢病毒構(gòu)建miR-122a過(guò)表達(dá)HepG2細(xì)胞系，并將其置于低濃度順鉑培養(yǎng)體系中，來(lái)觀察細(xì)胞的增殖是否被抑制，細(xì)胞是否更易凋亡，探討是否過(guò)表達(dá)miR-122a能夠提高HepG2細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，順鉑濃度1.5 μg/mL和3 μg/mL時(shí)，miR-122a腫瘤細(xì)胞組細(xì)胞的存活率低于腫瘤細(xì)胞組細(xì)胞的存活率，提示過(guò)表達(dá)miR-122a能明顯提高低藥物濃度時(shí)HepG2細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。Annexin V-PE/7-AAD檢查細(xì)胞的凋亡顯示，miR-122a轉(zhuǎn)染后凋亡率的升高，說(shuō)明miR-122a能有效的促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。這提示miR-122a在肝癌中可能發(fā)揮著抑癌基因的作用。

為了進(jìn)步探究miR-122a促進(jìn)細(xì)胞的凋亡的分子機(jī)制，我們首先選擇了bcl-2基因。bcl-2是迄今為止研究最明確的細(xì)胞凋亡拮抗基因，多項(xiàng)研究證實(shí)其高表達(dá)可抑制多種細(xì)胞凋亡從而參與多種腫瘤的發(fā)生，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯現(xiàn)，在低濃度順鉑溶液中，miR-122a腫瘤細(xì)胞組bcl-2表達(dá)量低于腫瘤細(xì)胞組，提示過(guò)表達(dá)miR-122a可促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡，提高其對(duì)化療藥物順鉑的敏感性。我們又選擇了p53基因，p53是最重要的腫瘤抑制因子之一，其表達(dá)的降低與功能的缺失在肝癌的形成及發(fā)展中都有十分重要的作用，化療藥物治療腫瘤的機(jī)理之一就是通過(guò)p53依賴途徑而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的。若p53基因失活或缺失，則其誘導(dǎo)的凋亡途徑不能進(jìn)行，化療藥物依賴p53誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡也不能進(jìn)行，腫瘤細(xì)胞則會(huì)對(duì)化療藥物不再敏感[14]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，miR-122a腫瘤細(xì)胞組P53表達(dá)量高于腫瘤細(xì)胞組，提示過(guò)表達(dá)miR-122a可通過(guò)提高p53表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞耐藥。

綜上所述，過(guò)表達(dá)miR-122a可提高HepG2細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的敏感性，為肝癌患者提供基因治療和降低腫瘤細(xì)胞耐藥提供了理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但增強(qiáng)化療藥物敏感性的機(jī)制有待進(jìn)一步探討，且在臨床實(shí)踐中的療效及安全性需進(jìn)一步證實(shí)。