針刺對腰椎間盤突出癥大鼠的鎮痛作用及對ERK信號通路的影響*

何 力，吳蘇寧，郭思佳，李春亮

（1.西寧市中醫院，青海 西寧 810000；2.青海省人民醫院，青海 西寧 810001）

腰椎間盤突出癥為臨床常見病、多發病，核心癥狀為神經根受壓所致根性痛，機械性壓迫、炎性改變為最基本病理因素[1]。西醫治療腰椎間盤突出癥方法較多，包括藥物、理療、手術等，但藥物、理療僅能短時間緩解疼痛，遠期效果不顯著；手術并發癥多，部分患者不耐受[2-3]。中醫典籍中并無“腰椎間盤突出癥”病名，根據癥狀體征可歸入“痹證”“腰痛”“腰腿痛”等范疇，筋脈痹阻、腰府失養、氣滯血瘀為主要病機[4]。針刺為中醫傳統治療手段之一，具有舒經通絡、活血化瘀、行氣止痛等功效，符合腰椎間盤突出癥病機[5]。但目前臨床仍未具體明確針刺對腰椎間盤突出癥的鎮痛作用及具體機制。本研究經動物實驗干預，分析針刺對腰椎間盤突出癥大鼠的鎮痛作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物50只健康雄性SPF級SD大鼠，購自北京科興中維生物技術有限公司，動物使用許可證號：SYXK（京）2019-0052。8周齡，體質量270～280 g。實驗前在22℃恒溫、50%濕度、12 h明/暗交替環境內適應性飼養7 d，自由獲得飲水、飼料。本研究動物處置符合“3R”標準，經動物倫理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 鹽酸利多卡因注射液（山東華魯制藥有限公司，國藥準字H37022147，批號：170226）；復方倍他米松注射液（比利時先靈葆雅公司，國藥準字J20130084，批號：20171128）；白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號：SBJ-R0546）、腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（批號：SBJ-R0040）均購自南京森貝伽生物科技有限公司；HE染色試劑盒（北京博奧森生物技術有限公司，批號：C02-04004）；兔抗大鼠磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶（phosphorylated-p38-Mitogen-activated protein kinase，p-p38 MAPK）一抗（批號：ab170099）、磷酸化胞外信號調節蛋白激酶1/2（phosphorylated-Extracellular-regulated kinase 1/2，p-ERK1/2）一抗（批號：ab2235007）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated-c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）一抗（批號：ab124956）及山羊抗兔IgG二抗（批號：ab6721）均購自美國Abcam公司。

1.3 主要儀器 華佗牌無菌針具（江蘇華佗器械有限公司，規格：0.22 mm×25 mm）；BL-420S型生物機能監測儀（成都泰盟軟件有限公司）；MoticBA 210光學顯微鏡（北京汗盟紫星儀器儀表有限公司）；Multiskan Sky全波長酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4 造模與分組50只大鼠中隨機取10只作為假手術組。另外40只建立腰椎間盤突出癥大鼠模型[6]：術前12 h禁飲禁食，2%戊巴比妥鈉50 mg/kg（0.25 mL/100 g）腹腔注射麻醉。于大鼠尾根部1 cm處，切下尾巴，切口消炎、縫合。尾部椎間盤切開，髓核取出，制備成自體髓核混懸液。隨后大鼠調整為屈曲側臥位，于L4～L5棘突間隙，9號腰椎穿刺針硬膜外穿刺。經微量注射器將自體髓核混懸液注入，隨后注入2%利多卡因30 μL。建模成功標準：大鼠麻醉清醒后無步態不穩、癱瘓、足外翻等表現，兩側后足熱痛刺激痛覺過敏檢測顯示出現對熱痛刺激產生痛覺反應的現象。40只大鼠建模成功34只，成功率85.00%。34只大鼠隨機分為模型組、針刺對照組、針刺組、陽性藥物組，動物數分別為8只、8只、9只、9只。假手術組不進行尾椎髓核植入操作，其余步驟同模型組。

1.5 實驗給藥 成功建模后3 d開始治療。陽性藥物組按照大鼠與人的體表面積比例換算用藥劑量，以2%利多卡因67.5 μL+倍他米松13.5 μL混合液進行左側臀大肌注射（10 mg/kg），1次/d，連續10 d。假手術組、模型組大鼠以等量生理鹽水行左側臀大肌注射，1次/d，連續10 d。針刺組按照張露芬《實驗針灸學》[7]選擇穴位，包括雙側夾脊穴、關元俞穴、大腸俞穴、委中穴、昆侖穴。穴區去毛、消毒，以毫針垂直刺入，深度1～2 mm，留針30 min，期間每隔10 min行針1次，采用平補平瀉法，1次/d，連續10 d；同時注射與其他組等量生理鹽水，1次/d，連續10 d。針刺對照組在以上各穴位外側約5 mm處為針刺點，并遠離上述穴位所在經脈，所用針具、針刺深度、行針方法同針刺組，1次/d，連續10 d；同時注射與其他組等量的生理鹽水，1次/d，連續10 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 大鼠行為學改變觀察 各組大鼠均在治療結束后隔日09∶00∶00—11∶00∶00，由固定人員按照盲法原則進行行為學檢測，觀察大鼠精神狀態，并記錄有無異常行為，如頻繁搖動尾巴、撕咬肢體、以嘴反復舔后爪、后肢或足部突然自發抬起等。

1.6.2 鎮痛效果檢測 治療后3 d，依據文獻進行機械刺激痛閾值檢測[8]：大鼠前半身包裹在小布袋內，雙后肢露出。布袋放置在電子天平上，待大鼠安靜后，天平調零。以1 mL注射器連接5號針頭（針尖磨鈍）制備成機械刺激痛閾測定器。檢測時以鈍針尖垂直刺激大鼠右側后爪Ⅳ/Ⅴ趾蹼，自輕到重施壓，直至大鼠出現縮爪反應或嘶叫，記錄出現這些反應時天平讀數，以此為機械刺激痛閾值（單位：g）。

1.6.3 感覺、運動神經傳導速度檢測 分別在治療后3 d（完成機械刺激痛閾值檢測后）進行感覺、運動神經傳導速度檢測。2%戊巴比妥鈉50 mg/kg（0.25 mL/100 g）腹腔注射麻醉，以生物機能監測儀檢測。感覺神經傳導速度：大鼠右側后爪內踝后內側放置刺激電極，L1棘突頭側放置記錄電極，L1棘突頭側向右1 cm處放置參考電極，臀大肌處放置接地電極，應用方波脈沖電流。參數設置：頻率2.0 Hz，波寬0.1 ms，強度2～4 mA。計算機自動測量潛伏期，并自動計算刺激位置至記錄位置的感覺神經傳導速度。運動神經傳導速度：進行經皮電刺激，分別在L1棘突、右側臀大肌臀紋處放置第一、第二點刺激。L1棘突處放置陽極，陽極下1 cm處放置陰極，右側后爪處放置接地電極，應用方波脈沖電流。參數設置：頻率5～10 Hz，波寬0.1 ms，強度5～8 mA。計算機自動計算刺激位置至記錄位置的運動神經傳導速度。

1.6.4 取材及處理 完成感覺及運動神經傳導速度檢測后，在大鼠麻醉未清醒前，斷頭處死，快速打開胸腔，心臟暴露。灌注針頭（50 mL針頭改制）插入心尖，經左心室進入主動脈，針頭固定，打開灌注裝置（輸液器改制）。右心耳剪開，灌注生理鹽水，直至肺、肝臟顏色自深紅色變為白色。隨后灌注含4%多聚甲醛（0.1 mol/L）的磷酸緩沖液400 mL。灌注后根據原手術位置逐層打開，取出L4、L5背根神經節組織，分為3份。2份置于液氮保存，以備檢測炎癥指標及各蛋白；1份置于4%多聚甲醛固定，以備HE染色觀察組織形態學改變。

1.6.5 IL-1β、TNF-α檢測 采用ELISA法檢測。取液氮保存背根神經節組織，按照1 g∶10 mL比例加PBS液，超聲粉碎，震蕩，制備勻漿。4℃10 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，取上清液。根據IL-1β、TNF-α試劑盒使用說明書完成操作。分別將不同程度標準品100 μL、待測樣本100 μL加入相應反應孔，各孔加50 μL酶聯親和物，混勻。封板膜封板，37℃溫育30 min。洗滌液洗滌30 s，沖洗5次，拍干。各孔（除空白孔）加50 μL酶標試劑，37℃溫育30 min。洗滌液洗滌30 s，沖洗5次，拍干。各孔先后加50 μL顯色劑A、B，震蕩混勻，37℃避光顯色15 min。各孔加50 μL終止液，反應10 min。20 min內觀察酶標儀450 nm波長處吸光度值。分別以吸光度值、標準品濃度為縱坐標、橫坐標，創建標準曲線，根據標本吸光度值獲得濃度。

1.6.6 組織形態學變化檢測 采用HE染色法檢測。取4%多聚甲醛固定背根神經節組織，置于包埋盒，生理鹽水沖洗。PBS溶液浸泡10～12 h。自動脫水機脫水，經包埋機、冰臺行石蠟包埋，切片，厚度4 μm，烤片機烤干。二甲苯透明，梯度酒精脫蠟，水洗。蘇木素染色5 min，加1%鹽酸酒精分化滲染脫漿內剩余蘇木素，流水沖洗30 min；伊紅染色3 min，水洗，梯度酒精脫蠟。二甲苯透明，中性樹膠封固。鏡下觀察脊神經根形態學變化，以NIS-ELements-BR3.1圖像采集系統拍照。

1.6.7 p-p38 MAPK、p-ERK1/2、p-JNK蛋白相對表達量檢測 采用蛋白質印跡法檢測。取液氮保存背根神經節，PBS液清洗2次，加RIPA裂解液，冰上裂解30 min。4℃12 000 r/min離心15 min，離心半徑10 min，取上清液。BCA法行蛋白定量，加上樣緩沖液，沸水浴變性10 min。離心取上清，取50 μg樣品10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白分離，轉至PVDF膜，加5%脫脂奶粉封閉1 h。加p-p38 MAPK（1∶1 000）、p-ERK1（1∶1 000）、p-ERK2（1∶1 000）、p-JNK（1:1 000）一抗，4℃，搖床孵育，過夜。TBST洗膜4次，每次10 min。加IgG二抗（1∶2 500），室溫孵育，2 h。TBST洗膜4次，每次10 min。加ECL增強化學發光試劑，Image Quant LAS4000生物分子成像儀曝光，觀察相應蛋白條帶灰度值。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值。

1.7 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件分析數據，計量資料以“均數±標準差”（s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 大鼠行為學改變 假手術組大鼠精神狀態良好，無異常行為。模型組大鼠出現頻繁搖動尾巴、撕咬肢體、以嘴反復舔后爪、后肢或足部突然自發抬起等異常行為，精神狀態較差，煩躁不安。針刺對照組大鼠行為學改變與模型組相似。與模型組、針刺對照組比較，針刺組、陽性藥物組大鼠異常行為減少，精神狀態有所緩解，其中陽性藥物組大鼠改善更顯著。

2.2 各組大鼠機械刺激痛閾值比較 各組大鼠機械刺激痛閾值比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與假手術組比較，模型組、針刺對照組、針刺組、陽性藥物組大鼠機械刺激痛閾值均降低（P＜0.05）；針刺對照組大鼠機械刺激痛閾值與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組、針刺對照組比較，針刺組、陽性藥物組大鼠機械刺激痛閾值均升高（P＜0.05）；與針刺組比較，陽性藥物組大鼠機械刺激痛閾值升高（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠機械刺激痛閾值比較s，g）

表1 各組大鼠機械刺激痛閾值比較s，g）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與針刺對照組比較，cP＜0.05；與針刺組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只） 機械刺激痛閾值假手術組 10 41.25±6.52模型組 8 24.25±3.62a針刺對照組 8 24.31±3.71a針刺組 9 30.15±4.02a b c陽性藥物組 9 38.95±4.95a b c d F 24.699 P 0.000

2.3 各組大鼠感覺、運動神經傳導速度比較 各組大鼠感覺、運動神經傳導速度比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與假手術組比較，模型組、針刺對照組、針刺組、陽性藥物組大鼠感覺、運動神經傳導速度均減慢（P＜0.05）；針刺對照組大鼠感覺、運動神經傳導速度與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組、針刺對照組比較，針刺組、陽性藥物組大鼠感覺、運動神經傳導速度均加快（P＜0.05）；與針刺組比較，陽性藥物組大鼠感覺、運動神經傳導速度的加快（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠感覺、運動神經傳導速度比較s，m/s）

表2 各組大鼠感覺、運動神經傳導速度比較s，m/s）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與針刺對照組比較，cP＜0.05；與針刺組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只）感覺神經傳導速度 運動神經傳導速度假手術組 10 25.69±3.42 37.12±3.22模型組 8 17.65±2.96a 30.02±2.85a針刺對照組 8 17.71±2.87a 30.05±2.91a針刺組 9 20.03±3.03a b c 32.06±3.02a b c陽性藥物組 9 22.96±3.41a b c d 35.04±2.82a b c d F 10.960 10.017 P 0.000 0.000

2.4 各組大鼠背根神經節組織中炎癥指標比較 各組大鼠背根神經節組織中IL-1β、TNF-α水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與假手術組比較，模型組、針刺對照組、針刺組、陽性藥物組大鼠背根神經節組織中IL-1β、TNF-α水平均升高（P＜0.05）；針刺對照組大鼠背根神經節組織中IL-1β、TNF-α水平與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組、針刺對照組比較，針刺組、陽性藥物組大鼠背根神經節組織中IL-1β、TNF-α水平均降低（P＜0.05）；與針刺組比較，陽性藥物組大鼠背根神經節組織中IL-1β、TNF-α水平均降低（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠背根神經節組織中IL-1β、TNF-α水平比較（s）

表3 各組大鼠背根神經節組織中IL-1β、TNF-α水平比較（s）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性藥物組比較，cP＜0.05；與針刺組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只）IL-1β（ng/L） TNF-α（ng/L）假手術組 10 2.18±0.35 32.82±3.41模型組 8 7.15±0.42a 77.98±5.39a針刺對照組 8 7.16±0.39a 77.91±5.41a針刺組 9 5.97±0.38a b c 58.66±4.38a b c陽性藥物組 9 3.89±0.35a b c d 41.15±3.32a b c d F 304.292 195.437 P 0.000 0.000

2.5 背根神經節組織形態學改變HE染色顯示，假手術組大鼠背根神經節中細胞核密度均勻，核仁清晰，胞漿中尼氏小體排列均勻；模型組大鼠背根神經節中細胞腫脹，細胞核出現不規則改變，核仁模糊，細胞漿出現空泡樣改變，胞漿中尼氏小體排列不均勻；針刺對照組大鼠背根神經節組織形態學改變同模型組相似；與模型組比較，針刺組、陽性藥物組大鼠背根神經節中細胞核邊緣、核仁較清晰，胞漿中尼氏小體排列較均勻，胞漿空泡樣改變減少，其中陽性藥物組改善更顯著。（見圖1）

圖1 各組大鼠背根神經節組織形態學改變情況（HE，×100）

2.6 各組大鼠背根神經節中p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對表達量比較 各組大鼠背根神經節中p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；與假手術組比較，模型組、針刺對照組、針刺組、陽性藥物組大鼠背根神經節中p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對表達量均升高（P＜0.05）；針刺對照組大鼠背根神經節中p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對表達量與模型組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組、針刺對照組比較，針刺組、陽性藥物組大鼠背根神經節中p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對表達量均降低（P＜0.05）；與針刺組比較，陽性藥物組大鼠背根神經節中p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對表達量降低（P＜0.05）。（見表4、圖2）

圖2 各組大鼠背根神經節中p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白表達情況比較

表4 各組大鼠背根神經節中p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對表達量比較

表4 各組大鼠背根神經節中p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對表達量比較

注：與假手術組比較，aP ＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽性藥物組比較，cP＜0.05；與針刺組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只）p-p38 MAPK p-ERK1 p-ERK2 p-JNK假手術組 10 0.15±0.02 0.13±0.03 0.09±0.02 0.08±0.02模型組 8 0.85±0.08a 0.91±0.08a 1.05±0.06a 0.78±0.05a針刺對照組 8 0.85±0.06a 0.91±0.06a 1.04±0.05a 0.77±0.06a針刺組 9 0.32±0.05a b c 0.41±0.05a b c 0.38±0.04a b c 0.42±0.04a b c陽性藥物組 9 0.17±0.02a b c d 0.23±0.04a b c d 0.19±0.03a b c d 0.11±0.02a b c d F 404.604 354.855 546.397 206.753 P 0.000 0.000 0.000 0.000

3 討 論

腰椎間盤突出癥主要是受慢性勞損、急性損傷、椎間盤退行性病變等因素影響，致髓核突出，纖維環破裂，繼而壓迫血管、神經造成的以腰腿痛為主要表現的疾病[9-10]。近年來，腰椎間盤突出癥患病率升高，且發病呈年輕化趨勢，嚴重影響人們日常生活、工作。手術治療可能給脊柱造成較大損傷，且手術創面大，并發癥多，部分患者不易接受。因此，腰椎間盤突出癥治療方法中，非手術治療占首要地位。局部應用麻醉藥物、硬膜外腔糖皮質激素注射等西醫非手術療法雖可在短期內緩解疼痛程度，但長期療效仍受爭議，且西藥長時間應用還可能導致不良反應[11]。中醫針刺能調節突出髓核、受壓神經根位置，使突出髓核萎縮減小，緩解神經根機械壓迫，且不良反應少，安全性高。研究[12]表明，針刺具有良好鎮痛功效，這與改善全身血液循環、減輕局部炎癥及水腫等作用有關。但目前中醫針刺對腰椎間盤突出癥的鎮痛作用及機制尚不明確。

有研究[13]顯示，針刺能促使血漿β-內啡肽活性提高，減弱痛覺過敏狀態，阻斷疼痛回路，發揮鎮痛作用。有學者提出，針刺腰椎間盤突出癥患者夾脊穴，可改善鎮痛評分，獲得顯著鎮痛效果[14]。孫鈺等[15]按照腰椎間盤突出癥患者分期，分別采用揚刺、齊刺、傍刺法治療，發現疼痛程度明顯減輕，取得較好療效。本研究針刺治療所選穴位包括雙側夾脊穴、關元穴、大腸俞穴、委中穴、昆侖穴，具有通絡化瘀、行氣止痛、溫通經脈之功效。本研究結果顯示，針刺治療后大鼠機械刺激痛閾值及感覺、運動傳導速度增加，行為學、背根神經節組織形態學異常改變減輕，IL-1β、TNF-α水平降低。這提示針刺治療可發揮鎮痛作用，促使神經傳導速度趨于正常，減輕炎癥反應。趙麗云等[16]也發現，腰椎間盤突出癥大鼠經針刺治療可改善機械痛覺觸覺閾值，減輕脊神經根、背根神經節損傷程度，與本研究共同證實了針刺的鎮痛功效。

ERK通路是一種介導細胞反應的重要信號通路，可經由將細胞外刺激信號向細胞內傳導，磷酸化下游底物，影響細胞的分化、增殖過程，相關蛋白包括p38 MAPK、ERK1/2、JNK等。有學者發現，ERK信號通路在神經可塑性、炎癥反應發生中發揮重要作用，且參與神經痛的痛覺過敏、痛覺異常形成及維持過程[17]。相關實驗還發現，背根神經節p38 MAPK/ERK信號通路激活，為髓核引發背根神經節神經痛、炎癥反應的必需過程[18]。這些研究均提示ERK信號通路可能在腰椎間盤突出癥疼痛發生及控制中有一定作用。本研究發現，針刺可促使大鼠背根神經節中p-p38 MAPK、p-ERK1、p-ERK2、p-JNK蛋白相對表達量降低，提示針刺治療可抑制腰椎間盤突出癥大鼠ERK信號通路，推測這可能是針刺發揮鎮痛作用的重要機制之一。

綜上所述，針刺對腰椎間盤突出癥大鼠有一定鎮痛作用，可改善神經傳導速度，緩解炎癥反應，減輕背根神經節損傷。作用機制可能與抑制ERK信號通路有關。本研究也存在不足之處，如所選腰椎間盤突出癥大鼠數量略少，可能影響結論可靠性；應用的動物模型由機械損傷誘導，與人體腰椎間盤突出病理過程有一定區別，今后需探索更好的動物模型。另外，針刺對腰椎間盤突出癥大鼠鎮痛作用的其他機制尚不明確，今后仍需進一步分析。