丹紫康膝沖劑通過抑制IKK/IκB/NF-κB信號通路改善膝骨關節炎大鼠關節軟骨、血瘀狀態的作用研究*

何 花，董大立

（湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙 410005）

膝骨關節炎（knee osteoarthritis，KOA）是我國40歲以上成年人最重要的致殘、致畸原因之一[1]。KOA在中醫學中屬“痹證”“骨痹”等范疇。痹者，三氣雜至，壅閉經絡，氣血凝滯而血行不暢，故血瘀病機是KOA的致病關鍵[2]。基于中藥具有辨證施治和多靶點治療的特色，活血化瘀通絡藥物更有助于改善KOA患者的臨床癥狀和延緩疾病進展。本研究擬通過建立KOA大鼠模型并分離軟骨細胞培養，觀察“磷酸化核因子B抑制蛋白激酶（phospho-inhibitor of NF-κB kinase，IKK）/核因子B抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）/核因子B（nuclear factor kappa B，NF-B）”信號通路相關因子的變化，并給予丹紫康膝沖劑干預，以闡述該中成藥對KOA大鼠滑膜組織IKK/IκB/NF-κB信號通路、炎癥因子及血瘀狀態的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康8周齡SPF級SD雄性大鼠70只，體質量200～220 g，購自湖南省中醫藥研究院實驗室，動物生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002。飼養溫度22～25℃，濕度45%～65%，給予標準飼料和飲用水，飼養環境為SPF級，所有實驗均按湖南中醫藥大學第二附屬醫院醫學倫理委員會和國際動物福利標準的指導方針進行[3]，倫理批號：2020-KY-021。

1.2 藥品與試劑 丹紫康膝沖劑由湖南中醫藥大學第二附屬醫院藥劑科提供，方藥組成：紫河車，丹參，熟地黃，懷牛膝，補骨脂，巴戟天，桑寄生，土鱉蟲，血竭，獨活，乳香，白芍，6 g/包，使用時溶于蒸餾水，根據需要配置成相應溶度懸混液；雙氯芬酸鈉腸溶片（廣東華南藥業集團有限公司，批號：20150404）；吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽（PDTC，核因子κB抑制劑）（美國Sigma公司，批號：1434953V）；兔抗鼠NF-κB抗體（北京奧森生物有限公司，批號：bs-1704R）；細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司，批號：20160409）；一氧化氮（nitric oxide，NO）ELISA檢測試劑盒（批號：20170301）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）ELISA檢測試劑盒（批號：20170715）、低氧誘導因子-1a（hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a）ELISA檢測試劑盒（批號：20180507）均購自上海賽默生物科技發展有限公司；anti-ColⅡ-IgG、IgG1和IgG2a ELISA試劑盒（北京中杉金橋生物科技有限公司，批號：20170209）；血栓素B2（thromboxane B2，TXB2）ELISA試劑盒（批號：201907）、6-酮-前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）ELISA試劑盒（批號：201908）均購自上海西唐公司；白細胞介素（interleukin，IL）-1β ELISA試劑盒（批號：ELK1372）、IL-18 ELISA試劑盒（批號：ELK13170）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號：ELK1458）均購自上海Elabscience公司；NF-κB p65抗體（批號：20170824A）、磷酸化NF-κB p65（phospho-NF-κB p65，p-NF-κB p65）抗體（批號：20180611A）、NF-κB抑制蛋白α（inhibitor of NF-κB α，IκBα）抗體（批號：20180509A）、磷酸化IκBα（phospho-IκBα，p-IκBα）抗體（批號：20190414A）、磷酸化IκB激酶α（phosphoinhibitor of NF-κB kinase α，p-IKKα）抗體（批號：20190920A）、磷酸化IκB激酶β（phospho-inhibitor of NF-κB kinase β，p-IKKβ）抗體（批號：20191123A）、Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor pyrin domain 3，NLRP3）抗體（批號：20180321A）均購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 主要儀器Varioskan LUX型多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Mini-PROTEAN Tetra Cell型小型垂直蛋白電泳儀（美國Bio-Rad公司）；脫水機、包埋機、組織攤片機（武漢俊杰電子有限公司）；TGL-18R型臺式冷凍離心機（珠海黑馬醫學儀器有限公司）；病理切片機（上海徠卡儀器有限公司）；載玻片及蓋玻片（江蘇世態實驗器材有限公司）。

1.4 造模與分組 將70只雄性SD大鼠飼養1周后，采用隨機數字表法分為假手術組，模型組，雙氯芬酸鈉組，PDTC組及丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組，每組10只。假手術組大鼠僅模擬手術過程，其余6組大鼠建立KOA模型。根據Hulth法[4]建立膝骨關節炎模型：腹腔注射10%水合氯醛將大鼠麻醉，固定在手術操作臺上，沿右側膝關節內側入路，充分暴露關節腔，切斷前交叉韌帶，經“前抽屜試驗”驗證呈陽性，則建模成功。縫合傷口。術畢，正常飼養，在傷口處涂抹抗生素，以防傷口感染。假手術組大鼠手術過程同模型組，但是不切斷前交叉韌帶。（見圖1）

圖1 假手術組和造模組大鼠交叉韌帶處理情況

1.5 實驗給藥 丹紫康膝沖劑成人劑量為0.3 g/kg，按成人（60 kg）與動物體表面積換算公式計算3組大鼠給藥劑量，根據低、中、高劑量組用藥量比例（1∶2∶4），丹紫康膝沖劑低劑量組大鼠每日劑量為0.15 g/kg（約相當于成人臨床日用量按體表面積折算的等效劑量），丹紫康膝沖劑中、高劑量組大鼠以每日0.3、0.6 g/kg的劑量進行灌胃；雙氯芬酸鈉組大鼠以每日5 mg/kg的劑量給予雙氯芬酸鈉灌胃；PDTC組以每日100 mg/kg的劑量進行灌胃；而假手術組、模型組分別給予1 mL/kg生理鹽水灌胃。1次/d，連續灌胃28 d。

1.6 觀察指標

1.6.1 HE組織染色[5]實驗結束后，頸椎脫臼處死大鼠，取膝關節軟骨組織，常規石蠟包埋，3 μm厚度做組織切片。經蘇木素染核和伊紅復染，中性樹脂封片后觀察。

1.6.2 番紅-O-固綠組織染色[6]石蠟包埋組織切片方法同上。新鮮配置的Weigert染液染色，在固綠染色液內浸染，加入番紅O染色，中性樹脂封固后觀察。

1.6.3 免疫組化法檢測軟骨組織NF-κB蛋白表達[7]收集膝關節軟骨組織，常規石蠟包埋組織切片。按照試劑盒說明書進行免疫組化染色操作，將兔抗鼠NF-κB抗體按1∶50稀釋，觀察胞核和胞漿中陽性染色情況。

1.6.4 蛋白免疫印記法檢測軟骨組織胞核蛋白和胞漿蛋白NF-κB蛋白表達[8]收集新鮮的膝關節軟骨組織，迅速放入預冷的研缽中搗碎，分別提取胞核蛋白和胞漿蛋白，取20 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉至聚偏二氟乙烯膜上，將NF-κB p65抗體和p-NF-κB p65抗體按1∶50稀釋，分別孵育過夜，ECL曝光后，對蛋白條帶進行掃描。

1.6.5 蛋白免疫印記法檢測軟骨組織總蛋白IκBα、p-IκBα、IKKα、p-IKKα、IKKβ、p-IKKβ、NLRP3蛋白表達[9]收集新鮮的膝關節軟骨組織，提取組織總蛋白，迅速放入預冷的研缽中搗碎，分別提取胞核蛋白和胞漿蛋白，取20 μg蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干轉至聚偏二氟乙烯膜上，加入IκBα抗體（1∶100稀釋）、p-IκBα抗體（1∶250稀釋）、p-IKKα抗體（1∶50稀釋）、p-IKKβ抗體（1∶300稀釋）、NLRP3抗體（1∶50稀釋），分別孵育過夜，TBST洗膜，ECL顯色，使用凝膠成像儀拍照，以被檢蛋白與GAPDH的吸光度比值作為其相對表達水平。

1.6.6 ELISA檢測血清炎癥因子[10]末次給藥后禁食24 h，摘眼球取血，離心分離血清，采用ELISA檢測試劑盒測定外周血炎癥因子（IL-1β、IL-18、TNF-α、HIF-1a、NO、PGE2）、抗-膠原抗體（anti-ColⅡ-IgG、anti-ColⅡ-IgG1和anti-ColⅡ-IgG2a）水平。

1.6.7 ELISA檢測血漿TXB2和6-keto-PGF1α水平[11]末次給藥后禁食24 h，摘眼球取血，用肝素鈉抗凝，離心機沉淀，留取血漿，采用ELISA檢測試劑盒測定血漿TXB2和6-keto-PGF1α水平，并計算比值。

1.7 統計學方法 利用SPSS 25.0軟件對數據進行統計分析，計量資料均以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析和重復測量的方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 丹紫康膝沖劑對KOA大鼠軟骨組織損傷的影響 經HE染色，假手術組大鼠膝關節關節面光滑，軟骨滑膜組織完整，細胞排列整齊；模型組大鼠軟骨組織可見大量炎癥細胞、中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，而且深部軟骨細胞可見明顯細胞核壓縮，胞質肥大，潮線消失，細胞排列不規則；與模型組比較，雙氯芬酸鈉組，PDTC組和丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠軟骨細胞排列均勻，胞核和胞質逐漸恢復正常。（見圖2）

圖2 各組大鼠軟骨組織HE染色結果 （×100）

經番紅-O-固綠染色，假手術組大鼠軟骨組織染色均勻，結構清晰；模型組大鼠骨關節面不平，軟骨鈣化，膠原纖維增生，軟骨細胞外基質經番紅O染色變淺，染色不均一，而且軟骨陷窩結構擴張；與模型組比較，雙氯芬酸鈉組，PDTC組和丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠軟骨組織番紅O稍淡染，潮線逐漸清晰，細胞排列逐漸均勻，尤其是丹紫康膝沖劑高劑量組大鼠軟骨組織改善明顯。（見圖3）

圖3 各組大鼠軟骨組織番紅-O-固綠染色結果 （×100）

2.2 丹紫康膝沖劑對KOA大鼠軟骨組織NF-κB蛋白核轉位的影響 經免疫組化分析，假手術組大鼠軟骨組織中NF-κB蛋白主要定位于細胞質中，胞核中的表達量相對較少；模型組和雙氯芬酸鈉組大鼠軟骨組織中NF-κB蛋白主要濃集于胞核區；而PDTC組和丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠軟骨組織中NF-κB蛋白發生核轉移的數量明顯減少，主要定位于細胞質中，尤其是丹紫康膝沖劑高劑量組和PDTC組大鼠軟骨組織中NF-κB蛋白核轉移的數量明顯少于丹紫康膝沖劑低、中劑量組。（見圖4）

圖4 各組大鼠軟骨組織NF-κB蛋白在軟骨細胞中的定位情況 （免疫組化，×100）

2.3 丹紫康膝沖劑對KOA大鼠軟骨組織NF-κB蛋白核表達的影響定量分析 與假手術組比較，模型組、雙氯芬酸鈉組、丹紫康膝沖劑低劑量組、丹紫康膝沖劑中劑量組、丹紫康膝沖劑高劑量組和PDTC組大鼠軟骨組織胞核和胞漿中NF-κB蛋白表達量均明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組和PDTC組大鼠軟骨組織胞核和胞漿中NF-κB蛋白表達量均明顯降低（P<0.05或P<0.01），尤其是丹紫康膝沖劑高劑量組和PDTC組大鼠軟骨組織NF-κB蛋白變化更明顯（P<0.01）。與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠軟骨組織胞漿中NF-κB蛋白表達量和丹紫康膝沖劑高劑量組大鼠軟骨組織胞核中NF-κB蛋白表達量均明顯降低（P<0.05）。與PDTC組比較，丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠軟骨組織胞核中NF-κB蛋白表達量均明顯升高（P<0.05）。（見表1、圖5）

圖5 Western blotting法檢測胞核和胞漿中NF-κB蛋白的表達情況

表1 各組大鼠軟骨組織中NF-κB蛋白表達情況比較

表1 各組大鼠軟骨組織中NF-κB蛋白表達情況比較

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01；與雙氯芬酸鈉組比較，dP<0.05；與PDTC組比較，eP<0.05

組別 動物數（只） 給藥劑量 胞漿NF-κB/GAPDH 胞核NF-κB/LaminB1假手術組 10 -模型組 10 -雙氯芬酸鈉組 10 5 mg/kg丹紫康膝沖劑低劑量組 10 0.15 g/kg丹紫康膝沖劑中劑量組 10 0.3 g/kg丹紫康膝沖劑高劑量組 10 0.6 g/kg PDTC組 10 100 mg/kg 0.02±0.01 0.39±0.05a 0.31±0.04a 0.10±0.03abd 0.12±0.05abd 0.08±0.01abcd 0.09±0.01abc 0.74±0.07 1.87±0.20a 1.65±0.17ab 1.76±0.18ae 1.62±0.15abe 1.19±0.12abcde 0.88±0.13abc

2.4 丹紫康膝沖劑對KOA大鼠軟骨組織總蛋白p-IκBα、IκKα、p-IKKα、IKKα、p-IKKβ、IKKβ、NLRP3蛋白表達的影響與假手術組比較，模型組，雙氯芬酸鈉組和丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠軟骨組織p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ、NLRP3蛋白相對表達量均明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，雙氯芬酸鈉組，丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組和PDTC組大鼠軟骨組織p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ、NLRP3蛋白相對表達量均明顯降低（P<0.05）。與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑中劑量組大鼠軟骨組織p-IκBα、p-IKKβ和丹紫康膝沖劑高劑量組大鼠軟骨組織p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ蛋白相對表達量均明顯降低（P<0.05）；與PDTC組比較，丹紫康膝沖劑中、高劑量組大鼠軟骨組織p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ、NLRP3蛋白相對表達量均明顯升高（P<0.05），丹紫康膝沖劑低劑量組大鼠軟骨組織p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ蛋白相對表達量均明顯升高（P<0.05）。6組大鼠軟骨組織IκBα、IKKα、IKKβ蛋白相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。（見表2、圖6）

表2 各組大鼠軟骨組織中p-IκBα、IκBα、p-IKKα、IKKα、p-IKKβ、IKKβNLRP3蛋白表達比較

表2 各組大鼠軟骨組織中p-IκBα、IκBα、p-IKKα、IKKα、p-IKKβ、IKKβNLRP3蛋白表達比較

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與雙氯芬酸鈉組比較，cP<0.05；與PDTC組比較，dP<0.05

組別 動物數（只） 給藥劑量 p-IκBα IκBα p-IKKα IKKα p-IKKβ IKKβ NLRP3假手術組 10 -模型組 10 -雙氯芬酸鈉組 10 5 mg/kg丹紫康膝沖劑低劑量組 10 0.15 g/kg丹紫康膝沖劑中劑量組 10 0.3 g/kg丹紫康膝沖劑高劑量組 10 0.6 g/kg PDTC組 10 100 mg/kg 0.03±0.01 0.47±0.02a 0.30±0.02ab 0.33±0.03abd 0.20±0.04abcd 0.18±0.03abcd 0.15±0.02ab 1.23±0.08 1.18±0.15 1.25±0.16 1.21±0.20 1.26±0.18 1.23±0.24 1.22±0.19 0.31±0.03 0.79±0.06a 0.50±0.05ab 0.57±0.04abd 0.50±0.03abd 0.42±0.02abcd 0.28±0.03b 2.31±0.16 2.24±0.29 2.38±0.30 2.40±0.27 2.37±0.28 2.39±0.40 2.44±0.42 0.11±0.02 0.48±0.09a 0.30±0.03ab 0.27±0.04abd 0.22±0.03abcd 0.20±0.02abcd 0.10±0.01b 1.45±0.11 1.39±0.14 1.48±0.22 1.40±0.15 1.43±0.12 1.42±0.10 1.45±0.13 0.54±0.08 0.87±0.08a 0.59±0.05ab 0.85±0.05ad 0.80±0.03abd 0.64±0.05ab 0.72±0.07abc

圖6 Western blotting法檢測軟骨組織中IκBα、p-IκBα、IKKα、p-IKKα、IKKβ、p-IKKβ、NLRP3蛋白表達情況

2.5 丹紫康膝沖劑對KOA大鼠炎癥狀態的影響 與假手術組比較，模型組，雙氯芬酸鈉組，PDTC組和丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠外周血IL-1β、IL-18、TNF-α、HIF-1a、NO、PGE2、anti-ColⅡ-IgG、anti-ColⅡ-IgG2a水平均明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，雙氯芬酸鈉組，PDTC組和丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠外周血IL-1β、IL-18、TNF-α、HIF-1a、NO、PGE2、anti-ColⅡ-IgG2a水平均明顯降低（P<0.05）。與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠外周血IL-1β、IL-18、TNF-α、HIF-1a、NO、PGE2、anti-ColⅡ-IgG2a水平均明顯升高（P<0.05）；與PDTC組比較，丹紫康膝沖劑高劑量組大鼠外周血IL-1β、TNF-α、HIF-1a、NO、PGE2、anti-ColⅡ-IgG水平均明顯降低（P<0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠外周血清細胞因子水平比較

表3 各組大鼠外周血清細胞因子水平比較

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與雙氯芬酸鈉組比較，cP<0.05；與PDTC組比較，dP<0.05

動物數 IL-1β IL-18 TNF-α Anti-ColⅡ(OD) HIF-1a NO PGE2（只） (pg/mL) (pg/mL) (pg/mL) IgG IgG1 IgG2a (ng/L) (μmol/L) (ng/L)假手術組 10 -模型組 10 -雙氯芬酸鈉組 10 5 mg/kg丹紫康膝沖劑低劑量組10 0.15 g/kg丹紫康膝沖劑中劑量組10 0.3 g/kg丹紫康膝沖劑高劑量組10 0.6 g/kg PDTC組 10 100 mg/kg組別 給藥劑量6.57±3.10 27.41±7.65a 10.36±3.48ab 25.33±3.21acd 21.05±3.79abcd 16.59±3.21abcd 19.70±4.25abc 1.33±0.24 6.77±1.49a 2.19±0.43ab 6.18±0.59abcd 6.02±0.47abcd 4.76±0.55abc 3.49±0.56abc 0.78±0.27 2.61±0.45a 0.96±0.34ab 2.51±0.48acd 2.26±0.29abcd 1.72±0.35abcd 2.04±0.62abc 1.31±0.03 1.90±0.07a 1.48±0.05ab 1.87±0.06a 1.85±0.10a 1.57±0.05abcd 1.82±0.04ab 0.78±0.03 0.75±0.02 0.76±0.01 0.74±0.02 0.77±0.05 0.74±0.02 0.77±0.03 0.53±0.02 1.20±0.04a 0.72±0.03ab 1.14±0.03abc 1.02±0.02abc 0.97±0.04abc 1.04±0.03abc 2189.47±697.32 4916.56±1374.25a 2954.83±729.46ab 4470.53±931.74acd 4055.12±799.21abc 3412.47±668.59abcd 4032.58±1285.97abc 17.40±2.81 35.40±4.16a 21.45±3.13ab 32.20±2.89abcd 31.77±3.65abcd 24.82±3.46abcd 27.33±4.27abc 105.69±18.72 187.67±24.75a 129.32±23.29ab 160.64±19.55abcd 151.30±25.38abcd 133.26±17.64abcd 180.94±19.62bc

2.6 丹紫康膝沖劑對KOA大鼠血瘀狀態相關因子的影響 與假手術組比較，模型組，雙氯芬酸鈉組，PDTC組和丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠血漿TXB2含量明顯升高，6-keto-PGF1a含量明顯降低，TXB2/6-keto-PGF1a比值明顯升高（P<0.05）。與模型組比較，雙氯芬酸鈉組，PDTC組和丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠血漿TXB2含量明顯降低，6-keto-PGF1a含量明顯升高，TXB2/6-keto-PGF1a比值明顯降低（P<0.05）。與雙氯芬酸鈉組比較，丹紫康膝沖劑低、中劑量組大鼠血漿TXB2含量明顯升高，TXB2/6-keto-PGF1a比值明顯升高（P<0.05）。與PDTC組比較，丹紫康膝沖劑低劑量組大鼠血漿TXB2含量明顯升高，6-keto-PGF1a含量明顯降低，TXB2/6-keto-PGF1a比值明顯升高（P<0.05）；丹紫康膝沖劑高劑量組大鼠血漿TXB2含量明顯降低，TXB2/6-keto-PGF1a比值明顯降低（P<0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠外周血漿TXB2和6-keto-PGF1a水平比較

表4 各組大鼠外周血漿TXB2和6-keto-PGF1a水平比較

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與雙氯芬酸鈉組比較，cP<0.05；與PDTC組比較，dP<0.05

組別 動物數（只） 給藥劑量 TXB2（ng/L） 6-keto-PGF1a（pg/mL） TXB2/6-keto-PGF1a假手術組 10 -模型組 10 -雙氯芬酸鈉組 10 5 mg/kg丹紫康膝沖劑低劑量組 10 0.15 g/kg丹紫康膝沖劑中劑量組 10 0.3 g/kg丹紫康膝沖劑高劑量組 10 0.6 g/kg PDTC組 10 100 mg/kg 176.44±34.10 279.61±37.65a 206.35±35.48ab 264.11±25.73abcd 236.29±28.64abcd 203.59±40.21abd 248.70±41.35abc 61.33±0.97 53.72±1.49a 55.19±1.03ab 55.16±1.18ab 55.25±0.92ab 55.89±1.17ab 56.49±3.56ab 2.88±0.19 5.20±0.67a 3.55±0.32ab 4.92±0.81abcd 4.26±0.86abc 3.46±0.38abd 4.40±0.54abc

3 討 論

中醫學認為膝骨關節炎發病與肝腎虧虛，風、寒、濕及瘀血客于局部有關，因局部氣滯血瘀，經脈痹阻不通而發病[12]。膝骨關節炎屬“痹證”范疇，腎虛、血瘀是“痹證”的主要病因，其病機腎虛為本，血瘀為標，因此中醫在治療痹證上，根據辨證，合理運用活血化瘀、祛風除濕、補益肝腎等藥物[13]。丹紫康膝沖劑是我院治療OA的經驗方，具有補肝益腎、活血通絡、柔肝止痛之功效[14]。經多年臨床研究證實，該方配伍精當，正中病機。此外，該方劑中丹參、土鱉蟲、血竭可活血化瘀，但是對于改善患者血瘀狀態的研究甚少，為臨床推廣帶來了一定的局限性。

在本研究中，我們建立KOA大鼠模型后，經軟骨組織病理觀察證實，丹紫康膝沖劑可以顯著改善大鼠軟骨組織的損傷狀態，而且其療效與非甾體類抗炎藥物雙氯芬酸鈉基本一致。從作用機制分析，該方劑對于IKK/IκB/NF-κB信號通路具有一定的抑制作用。NF-κB是參與機體炎癥反應、免疫調節、細胞凋亡等過程的重要轉錄因子，可在胞質中與NF-κB抑制蛋白（如IκBα）結合，形成無活性聚合體；而IKK是促進胞質IκBα蛋白磷酸化的重要上游激酶，可導致NF-κB蛋白發生核轉位，增強某些靶基因的轉錄。IKK/IκB/NF-κB信號通路激活后可誘導大量細胞因子如IL-1β、IL-18、TNF-α等大量分泌，造成軟骨損傷。此外，NLRP3炎癥小體在IKK/IκB/NF-κB信號通路激活過程中發揮著協同作用。在本研究中，丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠軟骨組織中p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ、NLRP3蛋白表達量均明顯低于模型組，且NF-κB核轉位減弱，尤其是丹紫康膝沖劑高劑量組改善最明顯，說明丹紫康膝沖劑對于IKK/IκB/NF-κB信號通路具有一定的抑制作用。此外，談冰等[15]證實NF-κB信號通路激活是OA患者凝血異常的原因之一。一方面NF-κB的激活可促進內皮細胞黏附分子的表達，另一方面可通過促進促炎因子的分泌，進一步放大血小板聚集、活化。在本研究中，我們發現丹紫康膝沖劑低、中、高劑量組大鼠血漿TXB2/6-keto-PGF1a比值均低于模型組，且逐漸恢復至假手術組大鼠狀態。

綜上所述，丹紫康膝沖劑不僅可抑制KOA大鼠的炎癥反應，減輕軟骨組織病理損傷，同時也可有效改善大鼠的血瘀狀態，其作用機制之一與抑制IKK/IκB/NF-κB信號通路的活化有關。在本研究中，我們通過Hulth法建立的大鼠模型證實了丹紫康膝沖劑對骨關節炎的治療作用部分依賴于對IKK/IκB/NF-κB信號通路的抑制，但不能完全闡明丹紫康膝沖劑治療膝骨關節炎的作用機制。在后續的研究中，我們將構建更多的動物模型，并從體外細胞層面和動物實驗兩方面進一步證實丹紫康膝沖劑的藥理作用，并綜合分析其作用機制，為丹紫康膝沖劑的臨床應用提供更可靠的實驗證據。