紫蘇葉多糖通過Wnt/PCP通路對慢阻肺大鼠氣道炎癥反應及氣道重塑的作用研究*

王文靜，劉雪梅，張桂琴

（包頭市第四醫院，內蒙古 包頭 014030）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是常見慢性呼吸道疾病，主要特征為氣流持續受限、肺功能下降，臨床表現為咳嗽、呼吸困難等。本病病程長，易反復發作，后期可引起慢性肺源性心臟病、呼吸衰竭等多種并發癥，嚴重危害人類生命健康[1]。氣道重塑是COPD的基本病理特征，是導致氣道狹窄及肺功能下降的重要因素[2]。目前臨床尚缺乏有效抑制氣道重塑的藥物，探索有效治療藥物對于延緩COPD進展、抑制氣道重塑具有重要意義。紫蘇是常用傳統中藥，已有研究證實，紫蘇在COPD中具有抗炎作用，可延緩疾病進展[3]。紫蘇葉是紫蘇的重要藥用部位，含有豐富維生素和蛋白質，具有較高食用和保健價值[4]。多糖是紫蘇葉重要活性成分之一，目前關于其對COPD是否有效報道尚少。本研究通過建立COPD大鼠模型，擬探討紫蘇葉多糖對COPD的影響及可能作用機制，為臨床治療COPD提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物8周齡SPF級健康雄性SD大鼠50只，體質量200～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，生產許可證號：SCXK（滬）2017-0005。購入后飼養于內蒙古自治區藥品檢驗研究院，使用許可證號：SYXK（蒙）2016-0004，保持溫度22～24℃，濕度50%～60%，明暗循環12 h/12 h，適應性飼養7 d，飼喂標準鼠糧及純凈水，大鼠自由采食飲水。實驗嚴格遵守《實驗動物管理條例》，確保動物福利倫理，經醫學實驗動物管理委員會審核批準，倫理審批號：BT201800036。

1.2 藥物與試劑 紫蘇葉多糖（陜西斯諾特生物科技有限公司，純度：98%，批號：2018112506）；中南海牌過濾嘴香煙（北京卷煙廠，批號：118204）；無翅型MMTV整合位點家族（wingless-type MMTV integration site family，Wnt）激動劑氯化鋰（lithium chloride，LiCl）（美國Sigma公司，批號：213233）；脂多糖（lip opolysacchari de，LPS）（北京索萊寶科技有限公司，批號：L2280）；大鼠白介素-8（interleukin-8，IL-8）ELISA試劑盒（批號：SEKR-0071）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號：YM-A7056）均購自北京索萊寶科技有限公司）；兔抗大鼠Wnt5a抗體（批號：ab227229）、ras同源蛋白A（ras-homologous A，RhoA）抗體（批號：ab187027）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinases，JNK）抗體（批號：ab126424）、p-JNK抗體（批號：ab2074477）均購自美國Abcam公司）。

1.3 主要儀器FlexiVent動物肺功能儀（加拿大SCIREQ公司）；JJ-12J脫水機和JB-P5包埋機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2016病理切片機（德國徠卡公司）；BA210T顯微鏡（麥克奧迪實業集團有限公司）；164-5056電泳儀（美國Bio-Rad公司）。

1.4 造模與分組 取40只大鼠，參照文獻[5]，采用煙熏聯合氣管滴入LPS復合法建立COPD大鼠模型。煙熏方法：自制有機玻璃煙熏箱，四周留直徑約1.5 cm的排氣孔，燃燒12支香煙，每次約10 min，間隔2 h，再燃燒1次。氣管內注入LPS：腹腔注射1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠，頸部消毒，切開皮膚后分離皮下組織，暴露氣管，向氣管內注入200 μL（1 μg/μL）LPS，注射完畢后使大鼠直立并左右旋轉，使LPS均勻分散至肺中，縫合皮膚，消毒創口。分別于實驗的第1天和第15天，氣管各注入1次LPS，其余時間每天將大鼠放入煙熏箱內按上述方法進行煙熏，共持續4周。實驗過程中，大鼠表現為精神萎靡，毛發無光澤并發生脫落，少動，呼吸急促，出現明顯咳嗽癥狀，表示造模成功，本實驗所有大鼠均造模成功。造模成功大鼠隨機分為模型組、LiCl組、紫蘇葉多糖組、紫蘇葉多糖+LiCl組，每組10只。另取10只大鼠作為假手術組，采用相同方法暴露氣管，注入等量生理鹽水，不進行煙熏。

1.5 實驗給藥 末次煙熏后24 h，LiCl組大鼠皮下注射LiCl，60 mg/kg，并灌胃生理鹽水；紫蘇葉多糖組大鼠皮下注射生理鹽水，并灌胃紫蘇葉多糖，20 mg/kg；紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠皮下注射LiCl，60 mg/kg，并灌胃紫蘇葉多糖，20 mg/kg；假手術組和模型組大鼠皮下注射并灌胃等量生理鹽水，1次/d，連續4周。

1.6 觀察指標

1.6.1 肺功能 末次干預后2 h，麻醉大鼠，頸部備皮，暴露氣管，進行氣管插管，采用肺功能儀檢測用力肺活量（forced vital capacity，FVC），1秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，FEV1），呼氣峰流速（peak expiratory flow，PEF）。

1.6.2 IL-8、TNF-α水平 肺功能檢測完畢后，隨機取5只大鼠，結扎右支氣管，用注射器抽取10 mL生理鹽水，分3次灌洗，30 s后緩慢回抽，收取肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），回收率＞80%。1 500 r/min，4℃離心10 min，取上清，按照ELISA試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀讀取450 nm吸光度值，根據標準曲線計算IL-8、TNF-α水平。

1.6.3 肺組織學觀察 灌洗完畢后，脫頸椎處死大鼠，切取右肺組織，浸入4%多聚甲醛中進行固定24 h，乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切片（片厚4 μm），常規HE染色，透明、脫水、封片，光學顯微鏡下觀察肺組織病理變化，每張切片隨機選取5個視野，參照李佳藝等[6]的方法，測量視野長度和寬度，計算視野面積，計數視野中肺泡總數，計算平均肺泡數（mean alveolar number，MAN），MAN=肺泡總數/視野面積；標記視野中央“十”字線的肺泡間隔數，測量“十”字線長度，計算肺泡平均間隔內襯（mean linear intercept，MLI），MLI=“十”字線長度/肺泡間隔數。

1.6.4 氣管壁及氣管平滑肌厚度 隨機選取每只大鼠HE切片中3個完整支氣管（直徑1 000～1 500 μm），使用Image圖像分析系統測定支氣管總面積、管腔面積、管壁內周長、平滑肌外側面積和平滑肌內側面積，支氣管壁厚度=（支氣管總面積-管腔面積）/管壁內周長，平滑肌厚度=（平滑肌外側面積-內側面積）/管壁內周長。

1.6.5 肺組織Wnt5a、RhoA、JNK、p-JNK蛋白 各組剩余大鼠脫頸椎處死后，取肺保存于液氮中，取100 mg凍存肺組織提取總蛋白，并進行定量，制備SDS-PAGE膠，蛋白上樣進行電泳，轉膜，加入封閉液室溫封閉1 h，加一抗4℃孵育過夜，洗膜，加二抗室溫孵育2 h，ECL發光，顯影，Image軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參β-actin灰度比值表示目的蛋白相對表達水平。

1.7 統計學方法 采用SPSS 25.0統計學軟件分析數據，計量資料以（s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠肺功能指標比較 與假手術組比較，模型組大鼠FVC、FEV1、PEF均降低（P＜0.05）；與模型組比較，LiCl組大鼠FVC、FEV1、PEF均降低，紫蘇葉多糖組大鼠FVC、FEV1、PEF均升高（P＜0.05）；紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠FVC、FEV1、PEF高于LiCl組（P＜0.05），而低于紫蘇葉多糖組（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠肺功能指標比較

表1 各組大鼠肺功能指標比較

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與LiCl組比較，cP＜0.05；與紫蘇葉多糖組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）FVC（mL）FEV1（mL） PEF（L/s）假手術組 10 - 10.36±0.65 5.13±0.15 35.52±1.59模型組 10 - 4.27±0.45a 2.09±0.09a 18.79±0.96a LiCl組 10 60 2.89±0.36b 1.65±0.08b 12.48±0.83b紫蘇葉多糖組 10 20 8.47±0.59b 4.21±0.13b 28.79±1.32b紫蘇葉多糖+LiCl組10 20+60 6.05±0.53c d 3.17±0.11c d 23.51±1.24c d F 333.782 434.076 531.774 P 0.000 0.000 0.000

2.2 各組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平均升高（P＜0.05）；與模型組比較，LiCl組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平均升高（P＜0.05），紫蘇葉多糖組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平均降低（P＜0.05）；紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平低于LiCl組（P＜0.05），而高于紫蘇葉多糖組（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平比較，ng/L）

表2 各組大鼠BALF中IL-8、TNF-α水平比較，ng/L）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與LiCl組比較，cP＜0.05；與紫蘇葉多糖組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）IL-8 TNF-α假手術組 5 - 254.13±26.42 265.46±13.49模型組 5 - 605.27±32.48a 365.79±18.16a LiCl組 5 60 687.61±33.51b 396.97±17.62b紫蘇葉多糖組 5 20 424.52±29.43b 303.58±14.79b紫蘇葉多糖+LiCl組5 20+60 538.91±31.46cd 331.62±15.67cd F 150.474 51.476 P 0.000 0.000

2.3 各組大鼠肺組織病理學變化 肺部大體觀察：假手術組大鼠肺表面光滑，體積正常，無斑點，呈粉紅色；模型組大鼠肺體積明顯增大，表面可見黑色斑點，呈蒼白色；LiCl組大鼠肺大體觀察與模型組相似，表面黑色斑點較多，呈蒼白色；紫蘇葉多糖組大鼠肺體積較模型組略大，斑點較少，呈粉紅色；紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠肺表面斑點多于紫蘇葉多糖組，但少于模型組，體積較大，呈粉白色。（見圖1）

圖1 各組大鼠肺組織大體觀察

HE染色顯示，假手術組大鼠肺泡結構正常，肺泡腔未見擴大，肺間隔未見增厚，未見明顯炎癥細胞浸潤；模型組大鼠肺泡腔擴大，部分融合成肺大泡，肺泡壁增厚，可見大量炎癥細胞浸潤；LiCl組大鼠肺組織病理變化與模型組相似，肺泡腔擴大、斷裂、融合，肺間隔增厚，出現的大量炎癥細胞；紫蘇葉多糖組大鼠肺組織病變較模型組明顯改善，肺泡結構大致正常，肺泡擴張明顯減少，炎癥細胞浸潤明顯減少；紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠肺組織病變較模型組明顯改善，但較紫蘇葉多糖組肺泡擴張嚴重，炎癥細胞增加。（見圖2）

圖2 各組大鼠肺組織病理學變化比較（HE，×200）

與假手術組比較，模型組大鼠MLI增加，而MAN減少（P＜0.05）；與模型組比較，LiCl組大鼠MLI增加，而MAN減少（P＜0.05），紫蘇葉多糖組大鼠MLI減少，而MAN增加（P＜0.05）；與紫蘇葉多糖組比較，紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠MLI增加，而MAN減少（P＜0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠MLI、MAN比較

表3 各組大鼠MLI、MAN比較

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與LiCl組比較，cP＜0.05；與紫蘇葉多糖組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）MLI（×10-6m）MAN（×106個/m2）假手術組 5 - 52.56±6.52 174.32±10.52模型組 5 - 102.49±8.96a 92.16±7.45a LiCl組 5 60 121.24±10.85b 76.85±7.16b紫蘇葉多糖組 5 20 71.23±8.15b 136.58±11.85b紫蘇葉多糖+LiCl組5 20+60 85.63±8.49cd 108.71±9.87cd F 46.969 81.875 P 0.000 0.000

2.4 各組大鼠支氣管壁及氣管平滑肌厚度比較 與假手術組比較，模型組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度均增加（P＜0.05）；與模型組比較，LiCl組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度均增加（P＜0.05），紫蘇葉多糖組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度均減小（P＜0.05）；紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度低于LiCl組，而高于紫蘇葉多糖組（P＜0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度比較±s，μm2/μm）

表4 各組大鼠支氣管壁厚度、平滑肌厚度比較±s，μm2/μm）

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與LiCl組比較，cP＜0.05；與紫蘇葉多糖組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）支氣管壁厚度 平滑肌厚度假手術組 5 - 18.26±1.35 11.47±1.13模型組 5 - 35.49±2.54a 24.56±1.87a LiCl組 5 60 43.76±3.32b 32.48±1.92b紫蘇葉多糖組 5 20 25.92±2.12b 14.39±1.26b紫蘇葉多糖+LiCl組5 20+60 29.96±2.35c d 19.65±1.49c d F 79.242 142.444 P 0.000 0.000

2.5 各組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、JNK、p-JNK蛋白水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、p-JNK蛋白相對表達量均增加（P＜0.05）；與模型組比較，LiCl組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、p-JNK蛋白相對表達量均增加（P＜0.05），紫蘇葉多糖組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、p-JNK蛋白相對表達量均減少（P＜0.05）；紫蘇葉多糖+LiCl組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、p-JNK蛋白相對表達量低于LiCl組（P＜0.05），而高于紫蘇葉多糖組（P＜0.05）。5組大鼠肺組織JNK蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。（見表5、圖3）

表5 各組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、JNK、p-JNK蛋白水平比較

表5 各組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、JNK、p-JNK蛋白水平比較

注：與假手術組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與LiCl組比較，cP＜0.05；與紫蘇葉多糖組比較，dP＜0.05

組別 動物數（只）給藥劑量（mg/kg）Wnt5a RhoA JNK p-JNK假手術組 5 - 0.13±0.03 0.25±0.04 1.08±0.11 0.26±0.05模型組 5 - 0.81±0.07a 0.79±0.07a 1.03±0.10 0.82±0.08a LiCl組 5 60 1.26±0.08b 0.93±0.08b 1.05±0.13 0.95±0.08b紫蘇葉多糖組 5 20 0.43±0.05b 0.51±0.05b 1.06±0.11 0.56±0.06b紫蘇葉多糖+LiCl組5 20+60 0.70±0.06cd 0.68±0.06cd 1.02±0.12 0.69±0.07cd F 245.123 91.079 0.218 73.666 P 0.000 0.000 0.926 0.000

圖3 各組大鼠肺組織中Wnt5a、RhoA、JNK、p-JNK蛋白表達電泳圖

3 討 論

COPD與慢性炎癥有關，反復慢性炎癥引起的氣道重塑是COPD進展的關鍵病理因素，氣道重塑過程始終伴隨氣道炎癥[7]。吸入煙霧或其他有害顆粒，可激活COPD患者體內巨噬細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞等釋放一系列炎癥介質，導致肺組織炎癥細胞浸潤；氣道壁釋放各種細胞因子或炎性介質等損傷局部組織，并介導異常修復過程，引起氣道壁增厚、氣道平滑肌增生肥大、細胞外基質沉積等，發生氣道重塑，最終造成氣管管腔狹窄，進行性氣流阻力增加[8-9]。本研究采用煙熏聯合LPS方法建立COPD大鼠模型，結果顯示，模型組大鼠肺體積增大，出現明顯斑點，呈蒼白色，MLI增加，MAN減少，支氣管壁及氣管平滑肌厚度增加，表明COPD模型建立成功，符合氣道重塑病理改變。

減輕炎癥反應，防治氣道重塑，是延緩COPD進展的關鍵。紫蘇葉具有止咳平喘、降氣化痰、潤腸通便、理氣止痛等功效。現代藥理學表明，紫蘇葉中含有黃酮類、多糖類、揮發油類等多種生物活性成分，具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗腫瘤等藥理活性[10]。PARK D D等[11]研究表明，紫蘇葉提取物可減輕TNF-α誘導的促炎反應，對小鼠結腸炎具有預防作用。有研究[12]顯示，紫蘇葉提取物可減輕LPS誘導的RAW264.7細胞炎癥反應，促進細胞增殖。本研究采用紫蘇葉多糖治療COPD大鼠，結果顯示大鼠肺功能有所提高，BALF中IL-8、TNF-α等炎癥因子水平下降，HE染色結果顯示肺泡結構大致正常，肺泡擴張明顯減少，炎癥細胞浸潤明顯減少，MLI減少，MAN增加，支氣管壁厚度、平滑肌厚度減小，提示紫蘇葉多糖可抑制COPD大鼠炎癥反應，減輕氣道重塑，改善肺組織病理損傷。

Wnt信號通路異常活化與呼吸系統疾病發生發展密切相關，Wnt5a可激活非經典Wnt信號通路，引起機體炎癥反應損傷氣道上皮[13]。平面細胞極性（planar cell polarity，PCP）途徑即Wnt/PCP途徑，是非經典Wnt信號通路之一，主要通過調節下游RhoA等表達，激活JNK途徑，破壞組織形態[14]。RhoA是Wnt/PCP途徑中的關鍵蛋白，能夠通過細胞張力調節細胞增殖，與肺部血管重建有關，其表達水平與慢性阻塞性肺疾病畸形加重期患者疾病嚴重程度成正相關[15]。JNK磷酸化進入活化狀態后，可調節下游信號分子，參與細胞生長、分化等多種過程。已有研究證實，Wnt/PCP通路在肺發育過程中發揮了重要作用，能參與肺氣腫、肺動脈高壓等肺部疾病的發生[16-17]。為進一步研究紫蘇葉多糖對COPD的作用機制，本研究使用Wnt通路激動劑LiCl干預COPD大鼠，結果顯示LiCl組大鼠肺組織Wnt5a、RhoA、p-JNK蛋白相對表達量高于模型組，大鼠肺功能、炎癥因子水平、肺部病理變化及氣道重塑情況更嚴重，表明Wnt/PCP通路激活可促進COPD進展；本研究在使用紫蘇葉多糖治療的基礎上同時使用LiCl干預，結果顯示，LiCl可抵消部分紫蘇葉多糖的改善作用。由此證實，紫蘇葉多糖改善COPD氣道重塑，可能與抑制Wnt/PCP通路有關。

綜上所述，紫蘇葉多糖可抑制COPD大鼠炎癥反應，減輕氣道重塑，可能與抑制Wnt/PCP通路有關。