桔梗總皂苷對(duì)反流性食管炎大鼠食管黏膜損傷的修復(fù)作用及對(duì)TLR4/NF-κB通路的影響*

李有連，張秉麗，霍成英

（青海仁濟(jì)醫(yī)院，青海 西寧 810021）

反流性食管炎（reflux esophagitis，RE）指胃、十二指腸內(nèi)容物反流至食管引起的食管炎性病變，典型癥狀為燒心、反酸和胸痛，嚴(yán)重者可出現(xiàn)食管黏膜糜爛出血及瘢痕形成，造成永久性損傷[1-2]。雖然亞洲人群RE發(fā)生率低于歐美國(guó)家，但近年來呈逐年上升趨勢(shì)[3]。質(zhì)子泵抑制劑、促胃動(dòng)力藥和抗抑郁藥是臨床常用的抗RE藥物，其中質(zhì)子泵抑制劑在抑制胃酸分泌和減輕RE患者的疼痛方面最有效，但仍有20%～30%的患者使用后無明顯效果[4]。另外，質(zhì)子泵抑制劑不能完全治愈RE，長(zhǎng)期使用質(zhì)子泵抑制劑還可能誘發(fā)嚴(yán)重不良反應(yīng)，尋找新的治療RE的藥物和方法具有重要意義[5]。桔梗為臨床常用中藥，具有止咳祛痰、宣肺、排膿等作用，桔梗總皂苷為桔梗主要活性成分，具有抗炎、抗氧化等藥理作用[6]。研究表明，含有桔梗的中藥方劑如桔梗枳殼湯、桔梗湯等對(duì)RE具有較好的治療作用，而桔梗治療RE的作用機(jī)制尚不清楚[7-8]。本研究擬探討中藥桔梗的主要活性成分桔梗總皂苷對(duì)RE大鼠的治療作用并探究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6周齡SPF級(jí)健康SD大鼠75只，體質(zhì)量180～220 g，雌雄各半，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)條件為室溫（22±2）℃，濕度（50±10）%，每天定時(shí)換氣，保持12 h∶12 h光暗照明，食水不限。研究方案獲醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)：QHRJ20200503。

1.2 藥物與試劑 桔梗總皂苷（西安冠宇生物技術(shù)有限公司，純度：80.75%，批號(hào)：20180127）；蘭索拉唑（江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：190504）；莫沙必利（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：170107）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)：E-EL-R2856c）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）試劑盒ELISA（批號(hào)：E-EL-R0896c）、超氧化物歧化酶（SOD）ELISA試劑盒（批號(hào)：E-BC-K022-M）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）ELISA試劑盒（批號(hào)：E-EL-0060c）均購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；RevertAidTM first Strand cDNA Synthesis Kit（美國(guó)Thermo Scientific，批號(hào)：K1622）；Toll樣受體4（tolllike receptor 4，TLR4）兔源單克隆抗體（批號(hào)：66350-1-Ig）、髓樣分化因子（myeloid differentiation factor88，MyD88）兔源單克隆抗體（批號(hào)：23230-1-AP）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）p65兔源單克隆抗體（批號(hào)：66535-1-Ig）均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.3 主要儀器IX53顯微鏡（日本奧林巴斯）；Multiskan MK3酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific）；7500型定量PCR儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）；DYCZ-24KS型雙板垂直電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.4 分組與造模75只SPF級(jí)SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、西藥組（蘭索拉唑+莫沙必利）、桔梗總皂苷高劑量組、桔梗總皂苷低劑量組，每組15只。除正常對(duì)照組外，其余各組大鼠均建立RE模型，造模方法參考文獻(xiàn)[9]，大鼠造模前1天禁食不禁水，腹部正中區(qū)域備皮、消毒、打開腹腔，幽門和十二指腸交界處使用幽門夾結(jié)扎至直徑4.2 mm，并用2-0線結(jié)扎2/3胃底，檢查大鼠胃和十二指腸部位無出血后，向腹腔注射5%甲硝唑1 mL和2萬IU慶大霉素，用3-0線縫合腹部切口。正常對(duì)照組大鼠不造模，僅在開腹后將胃及十二指腸等組織置于腹腔外5 min后關(guān)腹，術(shù)后禁食24 h。若HE病理切片檢測(cè)顯示大鼠食管黏膜層充血、潰瘍和糜爛，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞有壞死和增生現(xiàn)象，則表明RE模型建立成功。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 造模后第3天給藥，西藥組和桔梗總皂苷高、低劑量組大鼠的給藥劑量經(jīng)課題組前期研究確定[10]，西藥組大鼠灌胃蘭索拉唑（10 mg/kg）和莫沙必利（2 mg/kg）溶液，桔梗總皂苷高、低劑量組大鼠灌胃100、50 mg/kg桔梗總皂苷溶液，正常對(duì)照組和模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，1次/d，連續(xù)14 d。記錄大鼠術(shù)前及治療結(jié)束后的體質(zhì)量、存活率。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 HE染色觀察食管黏膜病理變化 末次給藥后2 h，將大鼠麻醉后處死，收集食管組織，4%多聚甲醛固定，蒸餾水清洗，脫水、透明后制作石蠟切片（厚度為4 μm），脫蠟、復(fù)水后行HE染色觀察食管黏膜病理變化，病理分級(jí)參考《RE診斷及治療指南》[11]進(jìn)行評(píng)定，反流性食管炎病理分級(jí)見表1，正常計(jì)為0分，輕度計(jì)為1分，中度計(jì)為2分，重度計(jì)為3分。（見表1）

表1 反流性食管炎病理分級(jí)

1.6.2 TNF-α、IL-6、MDA含量和SOD活力 剝?nèi)〈笫笫彻莛つそM織，加入預(yù)冷PBS緩沖液，冰上勻漿，10000 r/min離心10 min取上清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書步驟檢測(cè)食管黏膜組織TNF-α、IL-6、MDA含量和SOD活力。

1.6.3 Western blotting檢測(cè)TLR4、MyD88、NF-κBp65蛋白表達(dá)水平 剝?nèi)〈笫笫彻莛つそM織，冰上研磨勻漿，加入裂解液提取組織蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，加入loading buffer混勻后煮沸5 min使蛋白變性。配置15%的分離膠和5%的濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離蛋白，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入不同的一抗稀釋液，稀釋比例均為1∶1 000，4℃過夜，TBST清洗后將PVDF膜放入二抗稀釋液（1∶1 000）中，37℃孵育2 h洗膜，滴加發(fā)光液，置凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1.6.4 RT-PCR檢測(cè)TLR4 mRNA、MyD88 mRNA、NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平 剝?nèi)〈笫笫彻莛つそM織，冰上研磨，提取總RNA，使用RevertAidTM first Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，作為熒光定量模版。引物由日本Takara公司設(shè)計(jì)合成，所有樣品均以GAPDH為內(nèi)參。反應(yīng)體系：dNTPs 0.5 μL+5×Buffer 5 μL+Taq酶0.3 μL+MgCl21.5 μL+cDNA模板2 μL+上下游引物分別1 μL，加去離子水至總體積25 μL。反應(yīng)條件為：95℃5 min，95℃30 s，62℃30 s，72℃30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃5 min終止反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。采用2-△△CT的方法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)水平的變化。引物序列見表2。

表2 基因的引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件，實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的檢測(cè)均重復(fù)3次，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 體質(zhì)量及一般情況比較 造模前，各組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。治療結(jié)束后，模型組、西藥組、桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠體質(zhì)量均低于正常對(duì)照組（P＜0.05）。與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠精神狀態(tài)差，毛發(fā)凌亂無光澤，活動(dòng)和飲食減少，口周反流黃色黏液。與模型組比較，西藥組、桔梗總皂苷高劑量組大鼠體質(zhì)量增加（P＜0.05），精神狀態(tài)好，毛發(fā)略疏松，無反流黏液。西藥組大鼠體質(zhì)量與桔梗總皂苷高劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組大鼠體質(zhì)量均高于桔梗總皂苷低劑量組（P＜0.05）。正常對(duì)照組、模型組、西藥組、桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠存活率分別為100%（15/15）、73.33%（11/15）、86.67%（13/15）、93.33%（14/15）、80.00%（12/15）。（見圖1）

圖1 各組大鼠體質(zhì)量比較

2.2 各組大鼠食管黏膜病理變化比較 正常對(duì)照組大鼠食管黏膜正常。模型組大鼠食管黏膜上皮細(xì)胞可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分食管黏膜上皮細(xì)胞壞死、增生，黏膜糜爛，潰瘍區(qū)域有肉芽組織和纖維化形成，病理學(xué)評(píng)分高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。與模型組比較，西藥組、桔梗總皂苷高劑量組、桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜損傷明顯改善，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減輕，病理學(xué)評(píng)分降低（P＜0.05）。西藥組和桔梗總皂苷高劑量組大鼠食管黏膜部分區(qū)域呈現(xiàn)上皮增生，無明顯潰瘍和壞死區(qū)域，兩組病理學(xué)評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜組織偶見潰瘍、糜爛和細(xì)胞壞死，病理學(xué)評(píng)分高于西藥組和桔梗總皂苷高劑量組（P＜0.05）。（見圖2、表3）

圖2 各組大鼠食管黏膜組織病理變化比較（HE，×400）

表3 各組大鼠食管黏膜組織病理分級(jí)和評(píng)分比較

2.3 各組大鼠食管黏膜組織TNF-α、IL-6、MDA含量和SOD活力比較 與正常對(duì)照組比較，模型組、西藥組、桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜組織SOD活力均降低（P＜0.05），TNF-α、IL-6、MDA含量均升高（P＜0.05）。與模型組比較，西藥組、桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜組織SOD活力均升高（P＜0.05），TNF-α、IL-6、MDA含量均降低（P＜0.05）。與西藥組比較，桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜組織SOD活力均升高（P＜0.05），MDA含量均降低（P＜0.05），而TNF-α、IL-6含量與西藥組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），其中桔梗總皂苷高劑量組的作用優(yōu)于桔梗總皂苷低劑量組（P＜0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠食管黏膜組織TNF-α、IL-6、MDA含量和SOD活力比較）

表4 各組大鼠食管黏膜組織TNF-α、IL-6、MDA含量和SOD活力比較）

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與西藥組比較，cP＜0.05；與桔梗總皂苷高劑量組比較，dP＜0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）TNF-α（ng/L） IL-6（ng/L）MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）正常對(duì)照組 15 92.02±6.33 62.21±6.12 1.19±0.31 13.88±0.65模型組 11 251.36±10.12a 209.74±11.54a 2.98±0.40a 8.12±0.54a西藥組 13 160.22±9.57ab 139.97±7.97ab 2.21±0.28ab 8.88±0.72ab桔梗總皂苷高劑量組14 162.35±9.65ab 138.96±6.24ab 1.55±0.22abc 10.95±0.68abc桔梗總皂苷低劑量組12 190.25±11.96abcd 161.34±9.88abcd 1.84±0.35abcd 9.34±0.73abcd

2.4 各組大鼠食管黏膜組織TLR4/NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較 模型組、西藥組、桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜組織TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。西藥組、桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜組織TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于模型組（P＜0.05）。桔梗總皂苷高劑量組大鼠食管黏膜組織TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于西藥組和桔梗總皂苷低劑量組（P＜0.05）。（見圖3～4）

圖3 各組大鼠食管黏膜組織TLR4、MyD88和NF-κB p65蛋白表達(dá)Western blotting圖

圖4 各組大鼠食管黏膜組織TLR4、MyD88和NF-κBp65蛋白表達(dá)情況（）

2.5 各組大鼠食管黏膜組織TLR4/NF-κB信號(hào)通路mRNA表達(dá)比較 模型組、西藥組、桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜組織TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量均高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。西藥組、桔梗總皂苷高劑量組和桔梗總皂苷低劑量組大鼠食管黏膜組織TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于模型組（P＜0.05）。桔梗總皂苷高劑量組大鼠食管黏膜組織TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于西藥組和桔梗總皂苷低劑量組（P＜0.05）。（見圖5）

圖5 各組大鼠食管黏膜組織TLR4 mRNA、MyD88 mRNA和NF-κB p65 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（x±s）

3 討 論

RE是臨床多發(fā)的消化系統(tǒng)常見疾病，雖然多數(shù)患者經(jīng)質(zhì)子泵抑制劑等抑酸藥治療后病情得到顯著改善，但仍有部分患者療效較差，病情易反復(fù)，且長(zhǎng)期使用質(zhì)子泵抑制劑仍存在較多的不良反應(yīng)，尋找和開發(fā)新的治療藥物具有重要意義[12-13]。桔梗是桔梗科植物桔梗的干燥根，治療食管炎具有較好的臨床療效，其作用機(jī)制值得進(jìn)一步闡明[14]。桔梗中含有皂苷、黃酮、多糖等活性成分，皂苷被認(rèn)為是桔梗的特征性成分和主要活性成分[15]。本研究探討了桔梗總皂苷對(duì)RE大鼠的治療作用及其作用機(jī)制。

本研究顯示，RE模型大鼠體質(zhì)量降低，生存質(zhì)量下降，食管黏膜上皮層細(xì)胞有壞死和增生，部分組織呈纖維化狀態(tài)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，病理學(xué)評(píng)分顯著增加。桔梗總皂苷干預(yù)后，大鼠體質(zhì)量增加，食管黏膜損傷得到明顯改善，病理學(xué)評(píng)分低于模型組，表明桔梗總皂苷對(duì)RE食管黏膜損傷具有保護(hù)和修復(fù)作用。SOD是一種重要的抗氧化酶，SOD的水平可反映機(jī)體清除自由基的能力；MDA則與組織細(xì)胞受損程度相關(guān)，是氧自由基損傷組織細(xì)胞后產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物[16]。研究表明，食管黏膜損傷與局部氧自由基生成過多有關(guān)，應(yīng)用抗氧化劑可以預(yù)防和治療RE[9]。本研究結(jié)果表明，桔梗總皂苷可提高RE大鼠食管黏膜組織SOD活力，降低MDA含量，高劑量與低劑量桔梗總皂苷抗氧化應(yīng)激作用優(yōu)于西藥，表明一定劑量的桔梗總皂苷能抑制RE造成的食管黏膜組織氧化應(yīng)激損傷，也可能表明反流性食管炎的治療應(yīng)當(dāng)聯(lián)合外源性抗氧化劑，而不是僅使用抑酸藥和促胃動(dòng)力藥。TNF-α是炎癥趨化和激活因子，其含量與炎癥活動(dòng)呈正相關(guān)。IL-6是由活化的T細(xì)胞、B細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的多效應(yīng)細(xì)胞因子，具有廣泛的促炎作用[17]。本研究結(jié)果表明，桔梗總皂苷可降低RE大鼠食管黏膜組織TNF-α和IL-6含量，表明桔梗總皂苷能抑制反流性食管炎相關(guān)炎癥反應(yīng)。TLR4是一種細(xì)胞膜表面受體，通過識(shí)別病原體細(xì)胞壁的保守成分誘發(fā)機(jī)體炎癥免疫反應(yīng)。MyD88是Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）家族下游炎癥通路的經(jīng)典分子。MyD88可通過TLRs家族成員激活NF-κB信號(hào)通路，介導(dǎo)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)等病理過程[18-19]。研究表明，抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路可抑制炎癥、氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[20-21]。本研究結(jié)果表明，模型組大鼠食管黏膜組織TLR4、MyD88和NF-κB p65表達(dá)水平高于正常對(duì)照組，桔梗總皂苷干預(yù)后，TLR4、MyD88和NF-κB p65表達(dá)水平降低，表明桔梗總皂苷可抑制RE大鼠食管黏膜TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的激活。

綜上所述，桔梗總皂苷可減輕RE大鼠食管黏膜損傷，促進(jìn)組織修復(fù)，減輕炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號(hào)通路的活化有關(guān)。