通痹顆粒對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)及MMP-3、TIMP-1表達(dá)的影響*

柳玉佳，歐慧萍，吳伊瑩，王莘智，范伏元

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，湖南 株洲 412012）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以對(duì)稱性、慢性破壞性關(guān)節(jié)炎為主要臨床特征的自身免疫疾病[1]。其主要病理生理學(xué)特征為滑膜的慢性炎癥，并可出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨和骨質(zhì)的破壞[2]。如果不積極治療，可能會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷和不可逆轉(zhuǎn)的殘疾。隨著對(duì)RA發(fā)病機(jī)制的深入研究及早期診斷、早期治療重要性認(rèn)識(shí)的加強(qiáng)，其治療策略也發(fā)生了重大改變[3]。

RA骨免疫穩(wěn)態(tài)依賴于破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間的平衡。在RA滑膜微環(huán)境中，各種促炎因子的分泌與釋放，促進(jìn)了破骨細(xì)胞的分化能力，并經(jīng)由骨免疫微環(huán)境募集破骨前體轉(zhuǎn)化為成熟的破骨細(xì)胞，參與骨破壞進(jìn)程[4]。核因子κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor κB Ligand，RANKL）/核因子κB受體（receptor activator of nuclear factor κB，RANK）/骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）系統(tǒng)和基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）作為骨穩(wěn)態(tài)維持的重要信號(hào)，與RA的進(jìn)程密切相關(guān)。前期研究[5-7]發(fā)現(xiàn)，通痹顆粒能夠發(fā)揮多靶點(diǎn)調(diào)控作用，可有效緩解RA關(guān)節(jié)炎癥及骨質(zhì)破壞，然其具體機(jī)制尚未完全明確。本實(shí)驗(yàn)通過研究通痹顆粒對(duì)膠原性關(guān)節(jié)炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)及MMP-3、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP）-1表達(dá)的影響，進(jìn)而揭示通痹顆粒對(duì)RA骨破壞的干預(yù)作用及分子機(jī)制，以更好地指導(dǎo)臨床。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康雌性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。大鼠飼養(yǎng)于通風(fēng)良好的環(huán)境，室溫恒定在20～25℃，相對(duì)濕度40%～60%，標(biāo)準(zhǔn)光照。本實(shí)驗(yàn)已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審查，批準(zhǔn)號(hào)：20201010-35，并嚴(yán)格按照倫理要求進(jìn)行研究。

1.2 藥物與試劑 通痹顆粒，方藥組成：當(dāng)歸，黃芪，白芥子，血竭，僵蠶，甘草等，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑科提供，并由煎藥室制備濃縮為含生藥1 g/mL。雷公藤多苷片（湖南千金協(xié)力藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z43020138，規(guī)格：10mg/片）；牛Ⅱ型膠原（德國Biofroxx公司，批號(hào)：2275）；完全弗氏佐劑（美國Sigma公司，批號(hào)：SA-F5881）；兔抗鼠RANKL試劑盒（美國proteintech公司，貨號(hào)：23408-1-AP）；兔抗鼠RANK試劑盒（美國proteintech公司，貨號(hào)：111860）；兔抗鼠OPG試劑盒（美國proteintech公司，貨號(hào)：ab73400）；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)Marker（美國Sigma公司，貨號(hào)：V900372）；RIPA裂解液（武漢菁禾生物科技有限公司，貨號(hào)：P0013B）；BCA蛋白定量試劑盒（武漢菁禾生物科技有限公司，貨號(hào)：P1260）；RNA提取試劑盒（美國Thermo公司，貨號(hào)：15596026）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀(jì)公司，貨號(hào)：CW2569）；MMP-3 ELISA試劑盒（武漢菁禾生物科技有限公司，貨號(hào)：10374-1-AP）；TIMP-1 ELISA試劑盒（武漢菁禾生物科技有限公司，貨號(hào)：12899-1-AP）。

1.3 主要儀器PIKOREAL96型熒光定量RCP儀（美國Thermo公司）；1658033型電泳儀（美國Biorad公司）；DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜儀（北京六一生物科技有限公司）；BioPrep-24型生物樣品均質(zhì)儀（杭州奧盛儀器有限公司）。

1.4 造模與分組 將60只SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組，每組12只。除空白組外，其余4組大鼠行CIA造模，具體如下：牛Ⅱ型膠原蛋白冰浴后溶解在冰醋酸中，并用完全弗氏佐劑乳化，制備成牛Ⅱ型膠原。取制備好的牛Ⅱ型膠原0.2 mg于大鼠尾根部多點(diǎn)皮下注射進(jìn)行初始免疫，2周后同前法以0.1 mg進(jìn)行增強(qiáng)免疫，4周后進(jìn)行CIA模型評(píng)判。保證注射免疫后大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分≥6分，則為造模成功。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 造模成功后，藥物均按照人-大鼠體表面積換算為等效劑量，通痹顆粒低劑量組為換算后等效人臨床劑量，通痹顆粒高劑量組為等效人臨床劑量的2倍。換算后雷公藤多苷組大鼠灌胃雷公藤多苷溶液，給藥劑量為0.024 g/（kg·d）；通痹顆粒低、高劑量組大鼠灌胃給予通痹顆粒溶液，給藥劑量分別為9.600、19.200 g/（kg·d）；空白組、模型組大鼠予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)2周。

1.6 觀察指標(biāo) 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分和關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)量分別于治療第0、7、14天進(jìn)行。治療第14天后所有大鼠脫頸處死，腹主動(dòng)脈采血，3 000 r/min離心20 min，取上層血清-80℃條件封存，用于血清MMP-3、TIMP-1水平檢測(cè)；左膝關(guān)節(jié)滑膜組織剝離，福爾馬林液固定，用于滑膜組織病理形態(tài)學(xué)觀察；右膝關(guān)節(jié)滑膜組織剝離，放入液氮中速凍，-80℃條件下封存，用于滑膜RANKL、RANK、OPG的mRNA和蛋白檢測(cè)。

1.6.1 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分 根據(jù)大鼠關(guān)節(jié)受累情況進(jìn)行評(píng)分，具體如下：關(guān)節(jié)無任何紅腫為0分，紅腫僅累及足趾關(guān)節(jié)為1分，紅腫累及足底及足趾為2分，紅腫累及踝關(guān)節(jié)以下為3分，紅腫蔓延至全部足踝關(guān)節(jié)為4分。4個(gè)關(guān)節(jié)的評(píng)分累加即為大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，最大值為16分。

1.6.2 關(guān)節(jié)腫脹度測(cè)量 各組大鼠雙后踝關(guān)節(jié)同一位置做浸水線標(biāo)記，采用足跖腫脹度測(cè)量儀測(cè)量大鼠的足跖容積，以其變化情況來估測(cè)關(guān)節(jié)腫脹度。

1.6.3 滑膜組織病理學(xué)觀察 取固定好的大鼠左膝滑膜組織，EDTA溶液脫鈣，梯度酒精脫水，石蠟包埋，切片厚度約5 μm，并行組織HE染色，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下（×200）觀察其組織病理學(xué)形態(tài)。

1.6.4 滑膜組織RANKL mRNA、RANK mRNA、OPG mRNA表達(dá)檢測(cè) 取右膝滑膜組織，使用Trizol法提取總RNA，行RNA濃度及純度測(cè)定，并以組織總的mRNA為模板用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取互補(bǔ)的cDNA，后使用RT-PCR技術(shù)進(jìn)行基因擴(kuò)增和檢測(cè)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃15 s→60℃30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。收集熒光得到的曲線圖，以β-actin為內(nèi)參，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR程序分析，采用2-△△ct法計(jì)算目的RNA的相對(duì)表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6.5 滑膜組織RANKL、RANK、OPG蛋白表達(dá)檢測(cè) 將低溫保存的滑膜組織粉碎，采用Western blotting法，加入RIPA冰上裂解后勻漿離心取上清，嚴(yán)格按照BCA法測(cè)定各樣品蛋白濃度，并行SDS-PAGE電泳，恒流轉(zhuǎn)印于NC膜后封閉過夜，加入一抗室溫孵育90 min，PBST洗膜3次；二抗室溫孵育90 min，PBST洗膜3次，ECL顯色曝光。曝光后底片掃滿，以β-actin為內(nèi)參，用Quantity one專業(yè)灰度分析軟件分析條帶分子量及灰度值。

1.6.6 血清中MMP-3、TIMP-1水平檢測(cè) 離心好的血清室溫靜置，使用ELISA法測(cè)定血清中MMP-3、TIMP-1水平，具體操作按照說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，并行正態(tài)分布和單因素方差分析。若方差齊則以LSD檢驗(yàn)進(jìn)行比較；方差不齊則采用Tamhane’T2法。不同時(shí)間點(diǎn)的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分比較 治療前，模型組、雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分不同時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.512，P=0.000），即存在時(shí)間效應(yīng)，雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組均如此；各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分整體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=33.709，P=0.000），即存在分組效應(yīng)；與空白組比較，模型組、雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠治療第0、7、14天關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分均升高（P<0.05）；與模型組比較，雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠治療第7、14天關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分均降低（P<0.05）；通痹顆粒低劑量組大鼠治療第14天關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分與雷公藤多苷組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），通痹顆粒高劑量組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分低于雷公藤多苷組（P<0.05）。時(shí)間因素與分組因素存在交互效應(yīng)（F=9.214，P=0.000）。（見表2、圖1）

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分比較s，分）

表2 各組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分比較s，分）

注：F時(shí)間主效應(yīng)=7.512，P時(shí)間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=33.709，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=9.214，P交互效應(yīng)=0.000；與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與雷公藤多苷組比較，cP<0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量[g/(kg·d)]治療第0天 治療第7天 治療第14天 F P空白組 12 - 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 1.352 0.721模型組 12 - 8.67±1.07a 8.93±0.60a 8.75±0.17a 3.738 0.383雷公藤多苷組 12 0.024 8.69±0.76a 7.58±0.56a b 6.07±0.65a b 14.512 0.000通痹顆粒低劑量組12 9.600 8.67±0.97a 7.62±0.79a b 6.11±0.49a b 11.764 0.000通痹顆粒高劑量組12 19.200 8.66±0.84a 7.53±0.76a b 5.31±0.28a b c 17.043 0.000 F 15.961 30.118 36.732 P 0.633 0.002 0.000

2.2 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度比較 大鼠關(guān)節(jié)腫脹度不同時(shí)間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.373，P=0.000），即存在時(shí)間效應(yīng)，雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組均如此；各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度整體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.728，P=0.000），即存在分組效應(yīng)；與空白組比較，模型組、雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠治療第0、7、14天關(guān)節(jié)腫脹均升高（P<0.05）；與模型組比較，雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠治療第7、14天關(guān)節(jié)腫脹度均降低（P<0.05）；通痹顆粒低劑量組大鼠治療第14天關(guān)節(jié)腫脹度與雷公藤多苷組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），通痹顆粒高劑量組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度低于雷公藤多苷組（P<0.05）。時(shí)間因素與分組因素存在交互效應(yīng)（F=7.921，P=0.000）。（見表3、圖2）

表3 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度比較±s，mL）

表3 各組大鼠關(guān)節(jié)腫脹度比較±s，mL）

注：F時(shí)間主效應(yīng)=4.373，P時(shí)間主效應(yīng)=0.000；F分組主效應(yīng)=26.728，P分組主效應(yīng)=0.000；F交互效應(yīng)=7.921，P交互效應(yīng)=0.000；與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與雷公藤多苷組比較，cP<0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量[g/(kg·d)]治療第0天 治療第7天 治療第14天F P空白組 12 - 3.21±0.15 3.19±0.32 3.22±0.55 1.142 0.564模型組 12 - 4.27±0.28a 4.35±0.13a 4.13±0.57a 5.871 0.293雷公藤多苷組 12 0.024 4.25±0.17a 3.91±0.51ab 3.68±0.36ab 12.057 0.000通痹顆粒低劑量組12 9.600 4.28±0.18a 3.96±0.29ab 3.71±0.49ab 9.549 0.000通痹顆粒高劑量組12 19.200 4.26±0.23a 3.83±0.37ab 3.49±0.12abc 16.374 0.000 F 35.682 63.947 78.673 P 0.761 0.002 0.000

2.3 各組大鼠滑膜組織病理學(xué)改變情況 空白組大鼠滑膜形態(tài)正常，細(xì)胞排列整齊，未見滑膜增厚及血管新生；模型組大鼠滑膜重度增生，可見缺損及血管翳形成；雷公藤多苷組大鼠滑膜稍厚，可見輕度血管新生及少量炎癥細(xì)胞浸潤；通痹顆粒低劑量組大鼠滑膜中度增厚，可見輕度血管新生及少量炎癥細(xì)胞浸潤；通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜輕度增厚，血管新生不明顯，但可見少量炎癥細(xì)胞浸潤。提示經(jīng)過治療后，CIA大鼠滑膜病變有所改善，雷公藤多苷組和通痹顆粒高劑量組優(yōu)于通痹顆粒低劑量組。（見圖3）

圖3 各組大鼠滑膜組織病理學(xué)比較（HE，×200）

2.4 各組大鼠滑膜組織RANKL mRNA、RANK mRNA、OPG mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 與空白組比較，模型組、雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜組織RANKL mRNA、RANK mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P<0.05），OPG mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜組織RANKL mRNA、RANK mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P<0.05），OPG mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P<0.05）；且通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜組織RANKL mRNA、RANK mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯低于雷公藤多苷組（P<0.05），OPG mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于雷公藤多苷組（P<0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠滑膜組織RANKL mRNA、RANK mRNA、OPG mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

表4 各組大鼠滑膜組織RANKL mRNA、RANK mRNA、OPG mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與雷公藤多苷組比較，cP<0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量[g/(kg·d)]RANKL mRNA RANK mRNA OPG mRNA空白組 12 - 1.12±0.05 1.05±0.14 2.72±0.05模型組 12 - 2.78±0.12a 3.28±0.21a 1.31±0.17a雷公藤多苷組 12 0.024 1.79±0.16ab 1.67±0.17ab 1.85±0.07ab通痹顆粒低劑量組12 9.600 2.18±0.09ab 2.17±0.19ab 1.67±0.15ab通痹顆粒高劑量組12 19.200 1.46±0.07abc 1.31±0.08abc 2.18±0.12abc

2.5 各組大鼠滑膜組織RANKL、RANK、OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 與空白組比較，模型組、雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜組織RANKL、RANK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P<0.05），OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜組織RANKL、RANK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P<0.05），OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P<0.05）；且通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜組織RANKL、RANK蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于雷公藤多苷組（P<0.05），OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于雷公藤多苷組（P<0.05）。（見圖4、表5）

圖4 各組大鼠滑膜組織蛋白Western blotting條帶

表5 各組大鼠滑膜組織RANKL、RANK、OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量比較）

表5 各組大鼠滑膜組織RANKL、RANK、OPG蛋白相對(duì)表達(dá)量比較）

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與雷公藤多苷組比較，cP<0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只）給藥劑量[g/(kg·d)] RANKL RANK OPG空白組 12 - 1.65±0.13 0.14±0.02 0.76±0.03模型組 12 - 4.73±0.17a 0.59±0.04a 0.11±0.06a雷公藤多苷組 12 0.024 3.54±0.09ab 0.27±0.05ab 0.47±0.07ab通痹顆粒低劑量組12 9.600 3.61±0.14ab 0.31±0.01ab 0.41±0.05ab通痹顆粒高劑量組12 19.200 3.22±0.08abc 0.24±0.06abc 0.56±0.01abc

2.6 各組大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平比較 與空白組比較，模型組、雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平明顯降低（P<0.05）；且通痹顆粒高劑量組大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平低于雷公藤多苷組（P<0.05）。（見表6）

表6 各組大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平比較（s，pg/mL）

表6 各組大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平比較（s，pg/mL）

注：與空白組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與雷公藤多苷組比較，cP<0.05

組別 動(dòng)物數(shù)（只） 給藥劑量[g/(kg·d)] MMP-3 TIMP-1空白組 12 - 73.57±1.98 69.38±2.26模型組 12 - 87.35±2.23a 83.16±2.07a雷公藤多苷組 12 0.024 81.05±2.08ab 75.96±1.95ab通痹顆粒低劑量組12 9.600 83.72±1.52ab 79.44±2.06ab通痹顆粒高劑量組12 19.200 80.87±2.54abc 72.63±2.14abc

3 討 論

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）的病理特征為滑膜組織中過量促炎因子的產(chǎn)生，包括TNF-α、IL-1β和IL-6等。這些促炎因子不僅可以誘發(fā)MMPs的產(chǎn)生引起關(guān)節(jié)破壞，還可以經(jīng)由RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)激活成骨細(xì)胞或基質(zhì)細(xì)胞生成RANKL，進(jìn)而出現(xiàn)炎癥性骨侵蝕[8]。

RA骨免疫重塑異常會(huì)導(dǎo)致吸收增加，從而引起骨質(zhì)流失和骨化減少，并進(jìn)一步抑制骨修復(fù)而出現(xiàn)骨破壞[9]。破骨細(xì)胞是RA患者骨重塑失衡的主要細(xì)胞群，而作為其產(chǎn)生及活化的重要調(diào)控途徑，RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)發(fā)揮了重要作用。RANK的表達(dá)主要發(fā)生在破骨細(xì)胞中，而其活化因子配體RANKL則以跨膜蛋白形式廣泛表達(dá)于不同的骨細(xì)胞（成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞）及免疫系統(tǒng)的不同細(xì)胞亞群中，主要來源于RA的滑膜組織[10]。一旦RANKL與其受體RANK結(jié)合，破骨細(xì)胞的生成就會(huì)增加，從而發(fā)生骨免疫重塑異常導(dǎo)致骨質(zhì)流失，進(jìn)一步引起RA骨侵蝕。OPG是一種由基質(zhì)細(xì)胞和破骨細(xì)胞分泌的RANKL可溶性受體，它可以抑制RANKL與RANK的結(jié)合，從而妨礙破骨細(xì)胞生成和骨吸收[11]。因此，RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)是調(diào)節(jié)RA骨免疫代謝的重要途徑，抑制RANKL可能是預(yù)防RA骨侵蝕的潛在治療靶點(diǎn)[12]。MMPs是由成纖維樣滑膜細(xì)胞分泌的一組內(nèi)肽酶，可以降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，并對(duì)RA具有直接降解軟骨和骨質(zhì)的作用[13]。其中，MMP-3作為MMPs的重要組成成分，除了積極廣泛參與RA的關(guān)節(jié)破壞外[14]，還能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)RA早期階段的關(guān)節(jié)損傷情況，并能監(jiān)測(cè)疾病的活動(dòng)[15]。另外，MMP-3還可與其特異性產(chǎn)物TIMP-1結(jié)合，繼而通過MMP-3的活化發(fā)揮對(duì)血管侵襲和滑膜炎癥細(xì)胞浸潤的調(diào)控作用，兩者的一致性對(duì)于RA臨床預(yù)后有著顯著影響[16]。

RA屬中醫(yī)學(xué)“歷節(jié)病”“鶴膝風(fēng)”等范疇，現(xiàn)多以“尫痹”命名。《黃帝內(nèi)經(jīng)》云：“邪之所湊，其氣必虛”，《濟(jì)生方》亦載：“皆因體虛，腠理空疏，受風(fēng)寒濕氣而成痹也”。正虛是尫痹發(fā)病的內(nèi)在原因，正氣不足，腠理疏松，則易感邪而為痹[17]。《醫(yī)級(jí)·雜病》曰：“痹非三氣，患在痰瘀”，外邪痹阻經(jīng)脈關(guān)節(jié)，氣血運(yùn)行失暢，久則化為痰濁、瘀血，以致筋骨肌肉失于濡養(yǎng)，甚則僵硬強(qiáng)直、屈伸不利，最終形成疑難頑疾。本課題組結(jié)合前期研究[18]，提出了從“虛、瘀、痰”論治RA。據(jù)此研制出益氣養(yǎng)血、化痰逐瘀的協(xié)定方劑通痹顆粒，由當(dāng)歸、黃芪、血竭、白芥子、僵蠶、甘草等組成。方中重用當(dāng)歸為君，溫筋止痛，養(yǎng)血活血。黃芪甘溫為臣，大補(bǔ)肺脾元?dú)猓慌c當(dāng)歸相伍，共資氣血生化之源。僵蠶治風(fēng)化痰，散結(jié)通經(jīng)；血竭散瘀定痛，散滯和血；白芥子利氣豁痰，暖中散腫；三者皆為佐藥。以甘草為使，益氣健脾，調(diào)和諸藥。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，時(shí)間與組別的交互效應(yīng)對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分和關(guān)節(jié)腫脹度均有影響，經(jīng)過治療后，雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分和關(guān)節(jié)腫脹度均降低，治療第14天通痹顆粒高劑量組優(yōu)于雷公藤多苷組；經(jīng)治療后雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜病變均有改善，雷公藤多苷組和通痹顆粒高劑量組優(yōu)于通痹顆粒低劑量組。另外，本實(shí)驗(yàn)對(duì)CIA大鼠骨代謝的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠滑膜組織RANK、RANKL的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯降低，OPG mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯升高，且通痹顆粒高劑量組優(yōu)于雷公藤多苷組，提示通痹顆粒可以通過下調(diào)RANK、RANKL，上調(diào)OPG的表達(dá)來發(fā)揮對(duì)RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，與模型組比較，雷公藤多苷組、通痹顆粒低劑量組、通痹顆粒高劑量組大鼠血清中MMP-3、TIMP-1水平明顯降低，且通痹顆粒高劑量組優(yōu)于雷公藤多苷組，提示通痹顆粒能有效平衡CIA大鼠血清中MMP-3和TIMP-1的異常表達(dá)。

綜上所述，通痹顆粒能夠減輕CIA大鼠的關(guān)節(jié)炎癥，并對(duì)關(guān)節(jié)破壞具有一定的緩解作用，其機(jī)制可能與經(jīng)由RANKL/RANK/OPG系統(tǒng)和MMPs調(diào)控骨代謝的作用有關(guān)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)通痹顆粒對(duì)于CIA大鼠的治療呈現(xiàn)一定的劑量依賴性，即通痹顆粒高劑量組優(yōu)于通痹顆粒低劑量組，但其臨床應(yīng)用中是否也存在一定的劑量相關(guān)性，將是我們接下來重點(diǎn)研究的內(nèi)容。下一步我們將進(jìn)一步結(jié)合臨床，并從細(xì)胞分子水平探討通痹顆粒對(duì)RA的治療作用及其相關(guān)機(jī)制。