基于SIRT1通路茶黃素對慢性間歇低氧幼鼠氣道損傷及重塑的作用機制研究*

張冰潔，鄧敏超，魏 農，張曉楓

（江南大學附屬醫院，江蘇 無錫 214100）

阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）是一種以慢性間歇低氧為基本病理生理特征的肺部疾病，表現為睡眠中氣道反復塌陷（部分或全部），出現慢性間歇低氧與睡眠片段化。OSA往往與慢性氣道疾病并存，比如支氣管哮喘患者常合并OSA，但因哮喘癥狀掩蓋而影響OSA的診療，長期可加重哮喘病情，引起氣道損傷甚至重塑[1]。近些年發現提取自植物中的黃酮類化合物對OSA、哮喘等肺部疾病有明顯作用，其中紅茶中提取的茶黃素有良好的清除自由基、抗氧化、改善微循環等功效，同時對免疫調節、炎癥等亦有積極作用[2]。然而，茶黃素的藥理研究尚停留于實驗階段，關于其用于哮喘、OSA等肺部疾病中的作用及其機制報道鮮見。故本實驗模擬OSA的病理生理基礎，建立慢性間歇低氧幼鼠模型，并用茶黃素干預，觀察茶黃素對慢性間歇低氧幼鼠氣道損傷與重塑的作用，探討可能的作用機制，旨在為臨床治療慢性間歇低氧誘發的肺部疾病提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗動物38只3周齡SPF級健康雄性SD大鼠，體質量50～60 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2019-0010。實驗開展前適應性飼養1周，單籠飼養，溫度（24±2）℃，濕度40%～60%，自然光照，自由攝食水。本實驗中大鼠均為脫頸處死，實驗操作符合一般動物實驗倫理學原則，經醫學實驗動物管理委員會批準。

1.2 藥物與試劑 茶黃素（上海一基生物試劑有限公司，批號：20181225，純度＞99%）；沉默信息調節因子1（silent information regulator1，SIRT1）抑制劑Nicotinamide（北京百奧萊博科技有限公司，批號：20191109，純度＞99.5%，用時以生理鹽水溶解）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）ELISA試劑盒（批號：20190516）、超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）ELISA試劑盒（批號：20190519）均購自南京森貝伽生物科技有限公司；血管內皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）ELISA試劑盒（批號：20191022）、基質金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）ELISA試劑盒（批號：20190908）均購自武漢菲恩生物科技有限公司；金屬蛋白酶抑制劑-1（tissue inhibifor of metalloproteinase-1,TIMP-1）ELISA試劑盒（上海仁捷生物科技有限公司，批號：20190214）；兔抗小鼠腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK）一抗（批號：20191102）、磷酸化AMPK（p-AMPK）一抗（批號：2019000815）、SIRT1一抗、過氧化物酶增殖激活受體-γ共激活子-1α（peroxisome-proliferatoractivated receptor-γcoactivator-1α，PGC-1α）一抗（批號：20191214）、GAPDH一抗（批號：20190908）均購自上海聯邁生物工程股份有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG二抗（碧云天生物技術有限公司，批號：20191017）。

1.3 主要儀器CYE-Ⅱ型氧、二氧化碳氣體測定儀（上海嘉定學聯儀表廠）；間歇低氧艙、空氣模擬對照艙（自制，不銹鋼為主體，艙蓋中間為玻璃，氣體鋼瓶、流量計、減壓閥、控制程序、電磁閥、繼電器、顯示器等組成控制系統，間歇低氧艙大小為125 cm×48 cm×24 cm，側壁進氣、排氣單向閥各4個，空氣模擬對照艙大小60 cm×48 cm×24 cm，側壁進氣、排氣單向閥各2個，艙內壓力保持常壓）；醫用壓縮氧氣（濃度＞99.5%）、壓縮高純度氮氣（濃度＞99.9%）（溫州市醫用氧廠）；4V330V-10型電磁閥（寧波亞德客自動化工業有限公司）；EXL-808型酶標儀（美國BioTeK公司）。

1.4 造模與分組38只SD健康幼鼠留取8只作空氣對照組，其余建造慢性間歇低氧幼鼠模型[3]：將幼鼠置于間歇低氧艙內，將99.9%高純度氮氣、99.5%醫用氧氣交替輸入艙內，1次低氧-復氧循環為90 s，具體操作如下：通氮氣30 s（壓力0.3 kPa），停30 s，通氧氣12 s（氧流量25 L/min），停18 s，停止通氣期間由測氧儀分別檢測間歇低氧艙中氧濃度最高值、最低值。低氧濃度保持在7.8%左右，復氧濃度保持在21.0%左右，CO2濃度＜0.01%，濕度（50±10）%。每天艙內實驗時間為7.5 h（08:50:00—16:20:00）。空氣對照組幼鼠置于空氣模擬對照艙內，通壓縮空氣，由同一個單片機程控，條件同造模幼鼠。實驗期間艙上蓋厚布模擬黑夜，創造艙內黑夜條件，引導幼鼠進入睡眠狀態。每天出艙后，置于日光燈下模擬白天，飲食、活動不限。1次/d，連續低氧干預4周。30只造模幼鼠分為模型組、抑制劑組、茶黃素組，每組10只。

1.5 實驗給藥 茶黃素組幼鼠每天在進入間歇低氧艙前0.5 h腹腔注射60 μg/mL茶黃素[4]，抑制劑組幼鼠腹腔注射茶黃素60 μg/mL后，再腹腔注射SIRT1抑制劑Nicotinamide 20 mg/kg[5]，均以生理鹽水溶解至0.2 mL，模型組與空氣對照組幼鼠腹腔注射等體積生理鹽水。1次/d，連續2周，觀察幼鼠一般狀況。

1.6 實驗取材 干預4周后進行1%戊巴比妥鈉麻醉，股動脈取血，4℃3 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，取上清，分裝放置后凍存在-80℃冰箱，用于MMP-9、TIMP1、VEGF檢測；打開胸腔，暴露并游離肺組織，取右下肺葉組織，10%中性甲醛固定后進行病理檢測；取右肺上葉組織液氮冷凍，用于ELISA與Western blotting檢測。用注射器灌洗左肺，勻速注入左肺4 mL的0.9%無菌氯化鈉溶液，反復回抽3次后，收集肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），1 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，取其沉淀待測細胞計數。

1.7 觀察指標

1.7.1 幼鼠BALF中細胞計數 離心BALF后取沉淀細胞，以0.9%無菌氯化鈉溶液200 μL混勻，取20 μL細胞混懸液，以380 μL冰醋酸混勻，再次吸取20 μL混懸液，在血細胞計數板中用高倍顯微鏡計數有核細胞總數及淋巴細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞。

1.7.2 ELISA法檢測幼鼠肺組織MDA含量與SOD活力 取部分離體右肺上葉組織，4℃生理鹽水漂洗，用濾紙吸干水分，稱取1 g濕重肺組織，以4℃生理鹽水4 mL混勻，用玻璃勻漿器制備成勻漿，每次10 s，間隙30 s，共3～5次，冰水中操作。3 500 r/min離心15 min，離心半徑10 cm，取上清液，參考MDA、SOD ELISA試劑盒說明書，稀釋標準品，設置空白孔、標準孔、待測樣品孔并加樣，37℃溫育30 min，配液后洗滌，除空白孔外每孔加入酶標試劑，溫育，洗滌，顯色，終止，在450 nm波長處測定各孔吸光度值（OD值），重復實驗3次，取平均值。

1.7.3 HE染色觀察幼鼠肺組織病理 取10%中性甲醛固定的肺組織，脫水，透明，石蠟包埋，修剪蠟塊后連續切片，厚度約為4 μm。切片脫蠟復水后，蘇木精染色15 min，用自來水沖洗，提插數次，以75%鹽酸乙醇分化30 s，溫水（50℃左右）浸泡5 min，置入伊紅液2 min，常規脫水，透明，封片。圖像分析炎性指數，（×200）鏡下計數炎癥細胞，每張切片隨機抽取10個視野，取計數平均值。評定標準：無肺泡炎，計1分；輕度肺泡炎，肺泡隔增寬，病變范圍＜20%，計2分；中度肺泡炎，病變范圍占20%～50%，計3分；重度肺泡炎，病變范圍＞50%，彌漫性分布，計4分。

1.7.4 ELISA檢測血清VEGF、MMP-9、TIMP-1含量 取凍存的股動脈血清，參考VEGF、MMP-9、TIMP-1 ELISA試劑盒說明書進行檢測：設置標準孔、待測樣品孔與空白孔，每待測樣品孔中加入100 μL樣品，37℃溫箱中加入反應板2 h，棄液，濾紙印干洗滌反應板。每孔加入100 μL酶標試劑，37℃溫箱置入反應板1 h，洗板。每孔加入100 μL底物液，暗處反應，每孔加入50 μL終止液終止，450 nm處測量各孔OD值，計算VEGF、MMP-9、TIMP-1含量。

1.7.5 Western blotting檢 測 幼 鼠 肺 組 織AMPK、p-AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達 取另一部分離體右肺上葉組織，用勻漿器研碎，加入RIPA裂解液，12 000 r/min離心15 min，離心半徑10 cm，取上清。BCA法提取總蛋白，蛋白、上樣緩沖液混勻，沸水浴變性10 min，冷卻后取50 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉封閉2 h。條帶浸入一抗（AMPK稀釋1∶500、p-AMPK稀釋1∶1 000、SIRT1稀釋1:500、PGC-1α稀釋1∶500、GAPDH稀釋1∶1 000）中，4℃孵育過夜，次日加HRP標記的羊抗兔二抗（稀釋1∶2 000），室溫孵育2 h，取出聚偏二氟乙烯膜，PBS清洗3次，進行化學發光檢測，Quatity One凝膠軟件分析系統分析蛋白條帶灰度值。

1.8 統計學方法 采用SPSS 25.0統計軟件分析實驗數據，細胞計數、MDA濃度、SOD濃度、炎癥評分等計量資料以“均數±標準差”（s）表示，進行Levene與方差齊性檢驗，若方差齊，行單因素方差分析與LSD-t比較，不齊則進行Welch檢驗與Dunnett T3比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 幼鼠一般狀況8只空氣對照組幼鼠實驗過程中精神良好，毛發有光澤，進食、排便正常，體質量正常增長，未聞及異常呼吸音；30只造模幼鼠出現口唇發紺、呼吸急促、站立不穩等癥狀，表明造模成功。模型組幼鼠隨干預時間延長，上述表現日益明顯，且精神萎靡、毛色黃無光澤、進食減少、體質量增長緩慢，輕者氣喘，重者聞及喉間痰鳴音。茶黃素組、抑制劑組幼鼠精神、毛發、進食與排便等情況有所改善。

2.2 各組幼鼠BALF中細胞計數比較 與空氣對照組比較，模型組、抑制劑組、茶黃素組幼鼠BALF中細胞總數及嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞計數明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，抑制劑組、茶黃素組幼鼠BALF中細胞總數及嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞計數明顯減少（P＜0.05）；與抑制劑組比較，茶黃素組幼鼠BALF中細胞總數及嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞計數明顯減少（P＜0.05）。（見表1）

表1 各組幼鼠BALF中細胞計數比較s，×106/L）

表1 各組幼鼠BALF中細胞計數比較s，×106/L）

注：與空氣對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與抑制劑組比較，cP＜0.05

組別 動物數（只） 給藥劑量 細胞總數 嗜酸性粒細胞 淋巴細胞 中性粒細胞空氣對照組 8 - 9.64±1.28 0.55±0.07 1.23±0.04 0.25±0.04模型組 10 - 35.41±3.56a 3.52±0.11a 2.95±0.07a 0.99±0.08a抑制劑組 10 茶黃素60 μg/mL+Nicotinamide 20 mg/kg 22.16±2.89a b 2.44±0.13a b 2.22±0.05a b 0.74±0.09a b茶黃素組 10 60 μg/mL 14.66±1.77a b c 1.72±0.16a b c 1.78±0.06a b c 0.52±0.05a b c F 58.473 314.062 502.889 64.108 P 0.000 0.000 0.000 0.000

2.3 各組幼鼠肺組織MDA含量、SOD活力比較 與空氣對照組比較，模型組、抑制劑組、茶黃素組幼鼠肺組織中MDA含量均明顯升高、SOD活力均明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，抑制劑組、茶黃素組幼鼠肺組織中MDA含量均明顯降低、SOD活力均明顯升高（P＜0.05）；與抑制劑組比較，茶黃素組幼鼠肺組織中MDA含量明顯降低、SOD活力明顯升高（P＜0.05）。（見表2）

表2 各組幼鼠肺組織MDA含量、SOD活力比較

表2 各組幼鼠肺組織MDA含量、SOD活力比較

注：與空氣對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與抑制劑組比較，cP＜0.05

組別 動物數（只） 給藥劑量 MDA（nmol/mg）SOD（U/mg）空氣對照組 8 - 5.77±0.45 139.94±2.98模型組 10 - 12.69±0.23a 96.42±3.67a抑制劑組 10茶黃素60 μg/mL+Nicotinamide 20 mg/kg 10.12±0.17a b 112.66±2.69a b茶黃素組 10 60 μg/mL 8.64±0.21a b c 125.39±4.74a b c F 305.248 79.053 P 0.000 0.000

2.4 各組幼鼠肺組織病理變化情況HE染色肺組織病理切片可見：空氣對照組幼鼠氣道黏膜正常，氣道壁未見增厚，無炎癥細胞浸潤，未見明顯上皮細胞脫落；模型組幼鼠氣管壁增厚，可見大量上皮細胞脫落，大量炎癥細胞浸潤。與模型組比較，抑制劑組、茶黃素組幼鼠氣管壁增厚、上皮細胞脫落、炎癥細胞浸潤程度等有所減輕。（見圖1）

圖1 各組幼鼠肺組織病理切片圖（HE染色，×400）

與空氣對照組比較，模型組、抑制劑組、茶黃素組幼鼠肺組織炎癥評分均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，抑制劑組、茶黃素組幼鼠肺組織炎癥評分均明顯降低（P＜0.05）；與抑制劑組比較，茶黃素組幼鼠肺組織炎癥評分明顯降低（P＜0.05）。（見圖2）

圖2 各組幼鼠肺組織炎癥評分比較

2.5 各組幼鼠血清VEGF、MMP-9、TIMP-1含量比較 與空氣對照組比較，模型組幼鼠血清VEGF、MMP-9、TIMP-1含量均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，抑制劑組、茶黃素組幼鼠血清VEGF、MMP-9、TIMP-1含量均明顯降低（P＜0.05）；與抑制劑組比較，茶黃素組幼鼠幼鼠血清VEGF、MMP-9、TIMP-1含量均明顯降低（P＜0.05）。（見圖3）

圖3 各組幼鼠血清VEGF、MMP-9、TIMP-1含量比較

2.6 各組幼鼠肺組織AMPK、p-AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達比較 與空氣對照組比較，模型組幼鼠肺組織p-AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，抑制劑組、茶黃素組幼鼠肺組織p-AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05）；與抑制劑組比較，茶黃素組幼鼠肺組織p-AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05）。4組幼鼠肺組織AMPK蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖4～5）

圖4 各組幼鼠肺組織AMPK、p-AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達Western blotting圖

圖5 各組幼鼠肺組織AMPK、p-AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白相對表達量比較（x±s）

3 討 論

慢性間歇低氧指的是反復低氧、復氧交替過程，可激發呼吸、內分泌、神經等一系列病理生理改變，其所致肺損傷是哮喘、OSA等疾病發作的基本始動環節。有研究[6]認為，慢性間歇低氧可能通過系統性炎癥、氧化應激等途徑致病。中醫對慢性間歇低氧的研究尚處于起步階段，關于其誘發的氣道損傷與重塑可歸為“肺脹”范疇，主要從虛、瘀等方面進行辨證論治，但對慢性間歇低氧的基礎研究較少。然而，因慢性間歇低氧屬于特殊類型缺氧，而有抗缺氧效果的中藥較多，故可借其抗缺氧效應用于研究。近年來，現代藥理學研究發現，茶黃素生物學作用廣泛，不僅有抗病毒、抑菌、抗癌、抗炎、抗黏液高分泌、免疫調節等藥理作用，還是一種極為有效的抗氧化劑、自由基清除劑，在食品與醫藥保健等領域上的地位日漸突出[7]。茶黃素用于慢性間歇低氧致氣道損傷與重塑治療，取得了一定成效。

慢性間歇低氧可誘發慢性炎癥長期刺激，損傷氣道壁，出現氣道高反應性與氣流阻塞等情況，從而導致氣道重塑，主要表現為炎癥細胞浸潤、氣道平滑肌增厚等[8]。本研究結果顯示：與模型組比較，茶黃素組幼鼠BALF中細胞總數及嗜酸性粒細胞、淋巴細胞、中性粒細胞計數減少，提示茶黃素可減輕幼鼠肺部炎癥細胞浸潤。氣道重塑與炎癥細胞、炎癥因子長期存在所致氣道炎癥及慢性炎癥引起的氧化應激存在密切關系[9]。SOD是肺部內源性抗氧自由基損傷系統的重要物質，對機體氧化、抗氧化平衡有重要作用，測量肺部SOD濃度可間接反映氧自由基對肺組織細胞的損傷程度[10]；MDA是氧自由基代謝產物，能反映肺組織膜完整性受破壞程度[11]。本研究中，與模型組比較，茶黃素組幼鼠MDA含量降低、SOD活力升高，提示茶黃素可增強SOD活力，發揮抗氧化應激作用。氣道重塑由多種細胞因子參與，如MMP-9、VEGF、TIMP-1等。MMP-9是調節細胞外基質代謝的主要限速酶，在正常肺組織內幾乎不表達，可通過降解生長因子前體，激活生長因子，致氣道平滑肌增殖、肥厚，重塑氣道[12]。TIMP-1是MMP-9的主要抑制劑，可通過特異性抑制MMP-9生物學活性，增加細胞外基質沉積同時減少其降解，造成氣道重塑[13]。氣道炎癥及氣道重塑等均與VEGF相關，VEGF在OSA、哮喘等患者中表達明顯升高。藥物處理降低VEGF表達，可減輕機體肺部病理改變，提示氣道炎癥性損傷及重塑與VEGF有關[14]。本研究通過觀察幼鼠肺組織病理切片發現，與模型組比較，茶黃素組幼鼠氣管壁增厚、上皮細胞脫落、炎癥細胞浸潤等病理反應減輕，且肺組織炎癥評分降低，提示茶黃素可減輕氣道炎癥，保護氣管結構完整，改善氣道重塑。

SIRT1是目前研究最深入的Sirtuin蛋白，可與多種重要轉錄因子、轉錄共調控因子互相作用，經乙酰化作用調節基因轉錄、靶蛋白活性，從而參與衰老、代謝等發生發展，而這些過程多與缺氧有關。XUR Y等[15]發現白藜蘆醇可通過上調SIRT1表達減輕心肌缺氧/復氧誘導的細胞凋亡，推測SIRT1表達上調可能抑制細胞凋亡。PGC-1α在誘導細胞凋亡與炎癥反應中發揮著重要作用，與氧化應激關系最密切。HUANG J等[16]通過動物實驗發現上調PGC-1α與SIRT1表達可減輕氧化應激損傷，提示PGC-1α與SIRT1表達上調可能減輕氧化應激損傷，并抑制氧化應激損傷所致炎癥與細胞凋亡。AMPK被認為是應激反應酶，在能量缺乏情況下（如缺氧/復氧）被激活，可產生急性效應，輔助完成抗應激反應、維持生存的細胞行為[17]。AMPK在應激狀態下被激活，對細胞有保護作用，HUANGX T等[18]研究表明Galectin-1可通過AMPK-Nrf2途徑抑制肺部炎癥反應與氧化應激，說明AMPK參與了肺部炎癥反應、氧化應激過程。本研究結果顯示，與空氣對照組比較，模型組幼鼠肺組織中p-AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達下調，提示慢性間歇低氧可能通過抑制AMPK/SIRT1/PGC-1α通路造成氣道損傷與重塑；與模型組比較，抑制劑組、茶黃素組幼鼠肺組織中p-AMPK、SIRT1、PGC-1α蛋白表達上調，且茶黃素組高于抑制劑組，提示茶黃素可能通過激活AMPK/SIRT1/PGC-1α通路減輕慢性間歇低氧導致的氣道損傷，抑制氣道重塑。

綜上所述，茶黃素可能是通過上調AMPK/SIRT1/PGC-1α通路減輕慢性間歇低氧幼鼠氣道損傷、抑制氣道重塑，為臨床研發、應用茶黃素提供了實驗依據，對開辟慢性間歇低氧所致氣道損傷與重塑的治療提供了新方法。