痛風急性發作期的腸道菌群變化與中醫證型的相關性*

劉明嶺，何家穎，陳靖雯，鄧日輝，徐 強，林昌松

（廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405）

痛風是一種表現為發作性關節紅腫熱痛的炎性疾病。腸道菌群與痛風有密切關系。GUO Z等[1]通過腸道菌群測序技術分析，發現痛風患者的腸道菌群整體結構與健康人群具有顯著的差異，痛風患者腸道菌群中糞便擬桿菌（Bacteroides caccae）和木糖降解擬桿菌（Bacteroides xylanisolvens）致病菌豐度升高，而另2種益生菌普氏糞桿菌（Faecalibacterium prausnitzii）和假小鏈雙歧桿菌（Bifidobacterium pseudocatenulatum）豐度降低。腸道菌群失調可導致尿酸晶體誘導產生NLRP3炎癥小體相關的酶激活，最終導致痛風急性發作[2]。腸道菌群參與了嘌呤代謝酶的合成及炎癥因子的釋放[3]。ZAKHARZHE VSKAYA N B等[4]在動物模型中注射尿酸鹽結晶后觀察到了關節炎癥的發生，而在無菌小鼠模型中注射尿酸鹽結晶卻未見關節炎癥反應。腸道菌群在尿酸代謝、關節炎癥反應中均具有關鍵作用。

目前中醫研究認為，痛風急性發作最常見的病因病機是濕濁瘀熱痹阻關節[5]。《中醫內科病證診斷療效標準》有關痛風的證候分為4個證型，即濕熱蘊結、瘀熱阻滯、痰濁阻滯、肝腎陰虛[6]。本研究根據臨床痛風急性發作的常見證候，選擇濕熱蘊結與瘀熱阻滯進行探討。目前尚未見相關研究報道這2種證型客觀的物質基礎及其與腸道菌群的相關性。本研究采用宏基因組學技術研究腸道菌群與痛風急性發作的中醫證型的相關性，旨在揭示痛風急性發作的關鍵菌群及不同中醫證型的差異菌群，旨在為研究痛風急性發作的機制、中醫證型的物質基礎提供參考。

1 資料與方法

1.1 診斷標準

1.1.1 西醫診斷 痛風急性發作診斷參照2015年美國風濕病學會/歐洲抗風濕病聯盟痛風分類標準[7]，符合痛風診斷，符合1977年美國風濕病協會分類標準急性痛風關節炎的分類標準[8]。

1.1.2 中醫診斷 濕熱蘊結證與瘀熱阻滯證辨證參照《中醫內科病證診斷療效標準》中痛風的診斷依據、證候分類、療效評定[6]。（1）濕熱蘊結證：下肢小關節卒然紅腫熱痛、拒按，觸之局部灼熱，得涼則舒，伴發熱口渴，心煩不安，溲黃。舌紅，苔黃膩，脈滑數。（2）瘀熱阻滯證：關節紅腫刺痛，局部腫脹變形，屈伸不利，肌膚色紫暗，按之稍硬，病灶周圍或有塊瘰硬結，肌膚干燥，皮色暗黧。舌質紫暗或有瘀斑，苔薄黃，脈細澀或沉弦。

1.2 納入標準（1）符合痛風急性發作期診斷標準及中醫證候標準；（2）年齡18～65歲，性別不限；（3）本次就診為急性起病，病程在48 h內；（4）患者自愿接受并配合檢查。

1.3 排除標準（1）近3個月內使用過抗生素、益生菌等；（2）合并急性感染及有嚴重心腦血管疾病及嚴重肝腎功能損害；（3）有精神疾患或依從性差的患者；（4）妊娠或哺乳期婦女。

1.4 研究對象 本研究選擇2019年3月至2020年12月在本院風濕病科住院治療的痛風急性發作期患者40例，濕熱蘊結組與瘀熱阻滯組各20例。同時納入治未病中心健康體檢人群20人為健康對照組。本研究經廣州中醫藥大學第一附屬醫院倫理學委員會批準（NO.K[2019]096）。

1.5 觀察指標

1.5.1 臨床信息 參考《中醫病證診斷療效標準》[9]及《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》[10]設計病例信息記錄表，收集研究對象年齡、性別、體質量、身高、既往病史、痛風病史、癥狀、體征、中醫舌脈及相關檢驗指標等信息。體質量指數（BMI）=體質量（kg）/身高（m）2。

1.5.2 樣本采集與儲存 收集受試者新鮮自然排出的糞便約2 g，置于2 mL無菌凍存管中，置于-80 ℃冰箱保存。4 ℃冷藏條件下送至武漢華大醫學檢驗所有限公司進行測序和分析。

1.5.3 提取糞便DNA 采用MagPure Stool DNAKF kit B（Magen，中國）提取糞便中微生物群落DNA。質控采用BR Assay kit（Invitrogen，美國）對DNA進行熒光定量檢測。

1.5.4 DNA擴增與測序 采用16sRNA基因的V4區對基因組進行擴增，PCR引物上下游分別為，515F（5'-GTGCCAGCMGC CGCGGTAA-3'）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）。前后端均采用Illumina接合器、pad和連接子序列標記引物。PCR擴增前，模板濃度統一稀釋到0.6 ng/μL。PCR循環條件結果如下：95 ℃3 min，95 ℃30個循環45 s，56 ℃45 s，72 ℃45 s，72 ℃持續10 min。PCR產物采用Agencourt AMPure XP beads純化和緩沖液中洗脫。PCR擴增產物采用安捷倫科技2100生物分析儀進行質檢，合格后進行文庫構建。采用Illumina MiSeq測序平臺進行250 bp×2雙末端測序。下機后，要進行測序原始數據整理、過濾及質量評估；序列進行質控過濾后，接下來進行OTUs列表生成及注釋。

1.6 數據處理 測序完成后，對原始數據進行處理，步驟如下：（1）去掉質量低、模糊的數據；（2）利用FLASH 軟件（v1.2.11）對通過質量初篩的雙端序列根據短序列快速長度調整進行配對連接，獲得相應序列；（3）使用UPARSE軟件（v7.0.1090）對獲得的序列按97% cutoff值進行OUT歸類劃分，嵌合體序列使用UCHIME（v4.2.40）檢測與Gold數據庫進行比較；（4）根據最小置信度閾值為0.6，利用遺傳算法對OTU代表序列進行分類，采用核糖體數據庫項目（RDP）分類器v.2.2進行OTU分類，然后采用QIIME v1.8.0在Greengenes數據庫v201305上進行分析；（5）使用USEARCH-global將所有序列與OTU進行比較，以獲得各樣品OTU豐度統計表；（6）根據OTU在每個樣本中所包含的序列數，構建OTU在各樣本中豐度的矩陣文件；（7）采用MOTHUR（v1.31.2）和QIIME軟件（v1.8.0）對樣品序列進行Alpha、Beta多樣性分析；（8）采用QIIME軟件（v1.8.0）進行樣本聚類分析；（9）基于UPGMA、KEGG 和COG數據庫，采用PICRUSt軟件進行功能預測；（10）使用R軟件，根據OTU豐度矩陣和樣本分組數據構建PCoA分析，評估微生物群落的整體差異，根據OTU豐度矩陣表，使用R軟件對豐度前50名的微生物屬進行聚類分析并繪制heatmap聚類圖。

2 結果

2.1 臨床樣本統計分析 本研究共納入60名受試者，其中濕熱蘊結組、瘀熱組滯組與健康對照組各20人。入組人群的基本資料見表1。

表1 臨床研究人群基本資料

2.2 腸道菌群16SrDNA測定結果 60份糞便樣本總共獲得7 562 932條有效序列，人均126 049條clean reads，測序平均覆蓋度為98.16%。

2.3 腸道菌群物種注釋 依據測序結果，對測出的序列進行注釋，依照界、門、綱、目、科、屬和種對腸道菌群進行了注釋。測出的OTU總數為11 013個，對其進行注釋后，得到門共計11個，綱共計19個，目共計27個，科共計52個，屬共計138個，種共計226個。

圖1展示了綱水平的注釋結果，可進一步明確各個樣本的菌群分布情況，出現的菌群按照門水平平均相對豐度（relative abundance，RA）由高到低前5名分別為：Bacteroidetes（平均RA 為44.21%），Firmicutes（平均RA 為42.25%），Proteobacteria（平均RA為8.14%），Fusobacteria（平均RA為2.52%），Verrucomicrobia（平均RA為1.45%）。在屬水平，按照平均相對豐度由高到低前5名分別為：Bacteroides（平均RA為31.02%），Megamonas（平均RA為11.52%），Prevotella（平均RA為10.18%），Unclassified（平均RA為5.79%），Faecalibacterium（平均RA為4.46%）。

圖1 3 組樣本在綱水平的物種組成

2.4 腸道菌群的多樣性比較分析 Alpha多樣性指數（ACE、Chao1、Shannon、Simpson）顯示瘀熱阻滯組Alpha多樣性指數高于健康人群，而濕熱蘊結組的Alpha多樣性指數低于健康人群。上述4種多樣性指數值越高,表明群落的多樣性越高。3組比較，濕熱蘊結組略低于健康對照組，而瘀熱阻滯組高于濕熱蘊結組及健康對照組，但差異無統計學意義（P＞0.05）。（見圖2）

圖2 3 組間Alpha 多樣性指數

Beta（β）多樣性分析可以體現不同組之間的腸道菌群是否存在差異。β多樣性分析顯示：濕熱蘊結組顯著低于健康人群（R=0.052，P=0.007）；瘀熱阻滯組高于健康人群，差異無統計學意義（R=0.027，P=0.32），濕熱蘊結組低于瘀熱蘊結組，但差異無統計學意義（R=0.035，P=0.108），3組間菌群比較，差異有統計學意義（R=0.051，P=0.025）。（見圖3）

圖3 3 組間Beta 多樣性PCoA 分析

2.5 3組間菌群組成差異分析 菌屬豐度排在前10的為Bacteroidia、Clostridia、Negativicutes、Gammaproteobacteria、Fusobacteriia、Verrucomicrobiae、Actinobacteria、Bacilli、Betaproteo bacteria、Erysipelotrichia。其中濕熱蘊結組、瘀熱阻滯組與健康對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）的菌群為Bacteroidia（相對豐度降低）、Negativicutes（相對豐度升高）、Actinobacteria（相對豐度升高）、Bacilli（相對豐度升高）。NMDS分析證實3組在腸道菌群屬水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。（見圖4）

圖4 3 組間菌群組成差異分析

2.6 3組間菌群LEfSe分析 從LEfSe LDA圖可以看出3組間的差異菌群，篩選出有顯著差異Biomaker。圖中顯示瘀熱阻滯組的多樣性較豐富，代表性菌群較多，濕熱蘊結組次之，健康對照組最少。（見圖5）

圖5 3 組間菌群LEfSe 分析

2.7 3組間屬水平菌群結構差異熱圖分析 熱圖可顯示各樣本及組間的物種組成及豐度。與健康對照組比較，濕熱蘊結組、瘀熱阻滯組Bacteroidia、Fusobacteriia豐度降低，Clostridia、Negativicutes、Actinobacteria、Bacilli豐度升高。瘀熱阻滯組菌屬中Prevotella 菌群豐度上升，Clostridium_sensu_stricto、Clostridium_XlVb、Butyricimonas豐度降低；濕熱蘊結組菌屬中Bacteroides 菌群豐度上升，Paraprevotella、Dorea、Romboutsia豐度降低；健康對照組菌屬中Bacteroidia菌群豐度上升，Lactobacillus、Faecalicoccus、Pseudoflavonifractor、Acidaminococcus、Clostridium_IV、Dialister豐度降低。（見圖6）

圖6 基于腸道菌群屬水平差異物種的heatmap 聚類圖

3 討論

痛風是一種單鈉尿酸鹽沉積所致的晶體相關性關節病，與嘌呤代謝紊亂及（或）尿酸排泄減少所致的高尿酸血癥直接相關，屬代謝性風濕病范疇。我國痛風的患病率為1%～3%，逐年上升且呈年輕化趨勢[11]。高嘌呤飲食會導致痛風發作，具體機制尚不清楚。人體存在數量巨大的腸道菌群，對人的生理、病理有重要影響[12]。這些影響包括關節促炎與抗炎反應,與關節炎的發生、發展有關[13]。中醫學認為，痛風急性發作最常見的病因病機是濕濁瘀熱痹阻關節[14]。《中醫內科病證診斷療效標準》有關痛風的證候分類將痛風發作期的證型分為濕熱蘊結證與瘀熱阻滯證等證型[6]。這2種證型客觀的物質基礎，以及其與腸道菌群的關聯尚不明確。因此，本研究擬探討痛風急性發作期的腸道菌群變化及其與中醫證型的相關性。

本研究納入人群主要為中老年男性，男性占85%以上，符合痛風發病的優勢人群。痛風患者體質量均存在超重現象，明顯高于健康人群，且50%以上合并高血壓，較多合并糖尿病、高脂血癥、腎結石及腎功能不全，與國內有關痛風流行病學報道基本一致[15]。

本研究通過16SrDNA測序發現，痛風患者的腸道菌群與健康人群存在顯著差異，濕熱蘊結證與瘀熱阻滯證的痛風患者腸道菌群也存在差異。痛風急性發作期，主要表現為Bacteroidia豐度降低，Negativicutes、Actinobacteria、Bacilli豐度升高。而在不同證型之間，瘀熱阻滯組菌屬中Prevotella菌群豐度上升，Clostridium_sensu_stricto、Clostridium_XlVb、Butyric imonas豐度降低；濕熱蘊結組菌屬中Bacteroides菌群豐度上升，Paraprevotella、Dorea、Romboutsia豐度降低。這些升高的菌群絕大多數為致病菌，與炎癥、免疫密切相關，而降低的為益生菌，與抗炎作用有關[16-18]。因此，可以從腸道菌群的角度闡釋痛風出現急性炎癥的部分機制。

中醫辨證是中醫四診資料的高度概括，包括癥狀、體征、舌脈，這些變化與患者體質密切相關。本研究根據中醫辨證進行分組，研究不同證型之間的腸道菌群差異，以尋找這些證型客觀的物質基礎。腸道菌群的變化與人的體質有密切關系[19-20]，這或許可以解釋痛風急性發作期不同證型的菌群差異。目前有學者進行了中醫證型與腸道菌群的相關研究，但未見痛風的中醫證型與腸道菌群關系的相關研究報道。如周夢玲等[21]發現帕金森病內熱證擬桿菌門豐度升高，厚壁菌門豐度降低；安明偉等[22]研究表明慢性腹瀉脾胃濕熱證患者腸道需氧菌（腸桿菌、腸球菌）豐度升高；張寧等[23]研究發現寒凝血瘀證模型組大鼠中Firmicutes顯著上調，Bacteroidetes顯著下調。這些研究與本研究相似，均證實了腸道菌群變化與中醫證型的相關性。

本研究從腸道菌群的角度闡釋了痛風急性發作期不同證型與腸道菌群失調的關系，并為不同證型找到了可能的標志菌屬，為中醫辨證論治提供了客觀物質基礎，也可能為痛風急性發作的機制提供了研究線索。但本研究屬于探索性研究，發現的菌群尚需進一步驗證，如采用菌群移植法進一步驗證。因為本研究納入的均為住院患者，病例數偏少，兩種中醫證型在年齡、BMI、病程上存在差異，所以在病例選擇方面可能存在偏倚。因此，有必要擴大病例來源，增加樣本量，使得各組在基線水平保持一致。