多指標(biāo)優(yōu)選酒洗當(dāng)歸炮制工藝*

岳麗丹，趙永琪，張振凌，林秀敏，杜莉杰

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.中牟縣中醫(yī)院，河南 中牟 451450；3.河南省中藥特色炮制技術(shù)工程研究中心，河南 鄭州 450046；4.呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450046）

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根[1]，其味甘、辛，性溫，歸肝、心、脾經(jīng)，主治血虛萎黃、經(jīng)閉痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、崩中漏下等?！毒霸廊珪け静菡酚涊d：“當(dāng)歸，其味甘而重，故專能補(bǔ)血；其氣輕而辛，故又能行血。補(bǔ)中有功，行中有補(bǔ)，誠血中之氣藥，亦血中之圣藥也?！盵2]當(dāng)歸亦有“十方九歸”“婦科圣藥”之稱。當(dāng)歸具有辛香氣味，含揮發(fā)性成分α-蒎烯、檸檬烯等[3-4]，而且當(dāng)歸頭和當(dāng)歸尾化學(xué)成分含量有所不同[3]。當(dāng)歸身偏于補(bǔ)血，當(dāng)歸頭偏于止血，當(dāng)歸尾偏于活血，全當(dāng)歸偏于和血[5]。

2020年版《中華人民共和國藥典》收載的當(dāng)歸炮制品為酒炙當(dāng)歸，而近百部的古文獻(xiàn)對酒洗當(dāng)歸均有記載，《銀海精微》[6]中首次收載了當(dāng)歸酒洗炮制，記載了“酒浸”“酒洗”，《湯液本草》[7]對酒洗炮制作用有了記載，寫道“治外，酒洗”，《醫(yī)學(xué)入門》[8]記載“血病酒蒸，治上酒浸，治外酒洗”。其他省、自治區(qū)、直轄市藥品監(jiān)督管理部門制定的炮制規(guī)范如《上海市中藥飲片炮制規(guī)范》[9]記載：“酒洗當(dāng)歸：取當(dāng)歸，照酒炒法噴灑黃酒，拌勻，使之吸盡，曬干或低溫干燥。每100 kg當(dāng)歸片，用黃酒15 kg”。各省、市炮制規(guī)范具體操作方法不同，目前對于酒洗當(dāng)歸主要為利用HPLC指紋圖譜[10]的研究，以及不同濃度酒洗當(dāng)歸揮發(fā)性成分的研究[11]，未較系統(tǒng)地對酒洗當(dāng)歸炮制方法進(jìn)行深層次的研究。本研究采用（L934）正交試驗法對酒洗當(dāng)歸炮制工藝進(jìn)行優(yōu)選，以HPLC法測定酒洗當(dāng)歸中綠原酸、鄰苯二甲酸、香草酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯8種成分含量作為質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合外觀評價進(jìn)行綜合評分，并進(jìn)行驗證試驗，旨在優(yōu)選最佳酒洗當(dāng)歸炮制工藝，指導(dǎo)生產(chǎn)實踐，并為后期的研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters高效液相色譜儀（Waters公司，含Waters-2489檢測器，Waters-1525泵）；XMT-DA型數(shù)顯調(diào)節(jié)儀水浴鍋（余姚市亞星儀器儀表有限公司）；KQ-500DV型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SZ-93型自動雙重水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；GZX-9070型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；BS210S型萬分之一電子天平（北京SARTORIUS有限公司）；FW-200型高速萬能粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.2 材料 當(dāng)歸原藥材購自甘肅岷縣，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)科董誠明教授鑒定為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根；黃酒（古越龍山紹興花雕酒，陳年五年，酒精度：15.0%，浙江古越龍山紹興酒股份有限公司釀造；古越龍山精制清醇三年，酒精度：10.0%，浙江古越龍山紹興酒股份有限公司釀造；清爽型干黃酒，酒精度：12.0%，紹興水鄉(xiāng)黃酒釀造有限公司）；綠原酸對照品（批號：PS000627，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、香草酸對照品（批號：PS010559，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、洋川芎內(nèi)酯I對照品（批號：PS011036，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、洋川芎內(nèi)酯H對照品（批號：PS011038，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、阿魏酸松柏酯對照品（批號：PS011045，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞95%）、藁本內(nèi)酯對照品（批號：PS010999，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）均源自成都普思生物科技股份有限公司；鄰苯二甲酸對照品（批號：Y14J9Y18890，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，上海源葉生物科技有限公司）；阿魏酸對照品（批號：110773-201012，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，中國食品藥品鑒定研究院）；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純，雙蒸水實驗室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 酒洗當(dāng)歸飲片8種成分含量測定

2.1.1 色譜條件 WondaSil C18-WR（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相：乙腈（A）-0.1磷酸（B），梯度洗脫條件為0～25 min，3%→18%A；25～30 min，18%→26%A；30～35 min，26%→31%A；35～50 min，31%→33%A；50～70 min，33%→37%A；70～90 min，37%→54%A；90～100min，54%→3%A；流速：1 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。HPLC圖見圖1。

圖1 混合對照品（A）與酒洗當(dāng)歸樣品（B）的HPLC 圖

2.1.2 供試品溶液制備 取酒洗當(dāng)歸粉末（過三號篩）約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，稱質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液濾過，取續(xù)濾液，0.22 μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.1.3 對照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、鄰苯二甲酸、香草酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯H、阿魏酸松柏酯、藁本內(nèi)酯對照品適量，分別置于5 mL的容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得到各對照品母液。分別吸取適量對照品母液置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，得到一定濃度的混合對照品母液，結(jié)果見表1。

表1 對照品溶液的配制

2.1.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.3”項下混合對照品母液稀釋成一系列濃度，按照“2.1.1”項下色譜條件檢測，以對照品溶液進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，對照品峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（見表2）

表2 8 種成分線性方程

2.1.5 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，按照“2.1.1”項下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計算8種成分峰面積RSD值，RSD分別為1.59%、1.90%、2.11%、2.20、2.21%、2.42%、4.41%、4.60%，說明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，按照“2.1.1”項下條件在0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣測定，計算8種成分峰面積RSD值，RSD分別為1.14%、1.54%、2.86%、2.83%、2.93%、3.02%、3.09%、4.37%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 精密稱取同一酒洗當(dāng)歸樣品粉末6份，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下條件測定，計算8種成分含量的RSD值，RSD分別為1.24%、2.41%、2.80%、2.96%、3.16%、3.67%、4.09%、4.17%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精確稱取已知含量的酒洗當(dāng)歸樣品6份，每份0.20 g，分別精密加入8種成分對照品溶液適量，即對照品加入量與樣品中成分含有量之比約為1∶1，按照“2.1.2”制備供試品溶液，按照“2.1.1”項下條件測定，計算各成分加樣回收率和RSD值，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

續(xù)表3：

2.2 單因素考察 從黃酒用量、黃酒酒精濃度、干燥溫度分別考察，從外觀性狀和內(nèi)在品質(zhì)綜合評價，確定各單因素對酒洗當(dāng)歸飲片的影響。

2.2.1 評價方法 由于2020年版《中華人民共和國藥典》[1]未記載酒洗當(dāng)歸的外觀性狀評價方法，因此通過參考《上海市中藥炮制規(guī)范》[12]酒洗當(dāng)歸以“質(zhì)柔韌”和“香氣濃郁，略具酒香氣”為佳。以硬度和氣味來進(jìn)行評分，滿分各10分，分別記為W1和W2，即外觀性狀評分W0=W1+W2[13]，具體外觀性狀與評分見表4。質(zhì)量評價則照“2.1.2”項下制備供試品溶液，照“2.1.1”項下色譜條件測定。為使試驗結(jié)果能夠全面反映酒洗當(dāng)歸的質(zhì)量，本研究對外觀性狀分值與含量測定分值分別賦予一定的權(quán)重。由于硬度和氣味等外觀性狀依靠個人感官判斷，客觀性不足，權(quán)重不宜過高，賦予外觀性狀評分權(quán)重為40%，質(zhì)量評價評分權(quán)重為60%。綜合評分H=W0/Wmax×40+綠原酸/綠原酸最大含量×5+阿魏酸/阿魏酸最大含量×25+洋川芎內(nèi)酯I/洋川芎內(nèi)酯I最大含量×5+洋川芎內(nèi)酯H/洋川芎內(nèi)酯H最大含量×5+香草酸/香草酸最大含量×5+阿魏酸松柏酯/阿魏酸松柏酯最大含量×5+鄰苯二甲酸/鄰苯二甲酸最大含量×5+藁本內(nèi)酯/藁本內(nèi)酯最大含量×5，滿分為100分。其中，W0為酒洗當(dāng)歸的外觀性狀得分，Wmax為其外觀性狀得分最大值[14]。

表4 酒洗當(dāng)歸的外觀評價表

2.2.2 黃酒用量單因素試驗 取當(dāng)歸飲片3份，每份50 g，黃酒濃度為15%，用酒量5.0、7.5、10.0 g，40 ℃烘干，計算綜合評分，結(jié)果見表5。

表5 黃酒用量考察結(jié)果

2.2.3 黃酒酒精濃度單因素試驗 取當(dāng)歸飲片3份，每份50 g，黃酒濃度為10%、12%、15%，用酒量7.5 g，40 ℃烘干，計算綜合評分，結(jié)果見表6。

表6 黃酒濃度考察結(jié)果

2.2.4 干燥溫度單因素試驗 取當(dāng)歸飲片3份，每份50 g，黃酒濃度為15%，用酒量7.5 g，干燥溫度為40、50、60 ℃，計算綜合評分，結(jié)果見表7。

表7 干燥溫度考察結(jié)果

2.3 正交試驗 通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)及單因素實驗，最終選用正交表，以每份100 g當(dāng)歸的飲片，以酒精濃度、黃酒用量、干燥溫度為考察因素，每個因素下取3個水平，以“2.2.1”項下的綜合評分為評價指標(biāo)，因素水平見表8。

表8 正交試驗設(shè)計因素水平表

2.4 結(jié)果

2.4.1 正交試驗結(jié)果 由表9數(shù)據(jù)可知，酒精濃度因素K2＞K1＞K3，用酒量因素K3＞K1＞K2，干燥溫度因素K1＞K3＞K2。由方差分析表可知，酒精濃度、黃酒用量、干燥溫度對酒洗當(dāng)歸質(zhì)量有顯著性響。結(jié)合直觀分析數(shù)據(jù)，可得酒洗當(dāng)歸的最佳工藝是A2B3C1，即酒精濃度15%，黃酒用量20 g，干燥溫度40 ℃。（見表9～10）

表9 正交實驗結(jié)果表

表10 正交實驗方差分析表

2.4.2 驗證試驗結(jié)果 取同一批次當(dāng)歸藥材3份，每份100 g，采用酒洗當(dāng)歸工藝優(yōu)化參數(shù)進(jìn)行酒洗當(dāng)歸工藝再驗證。按“2.1”項下含量測定方法進(jìn)行多成分含量測定，并進(jìn)行外觀性狀評分。結(jié)果見表11。

表11 工藝驗證實驗結(jié)果

3 討論

當(dāng)歸具有良好的活血功效，與不同的藥物配伍使用可用于各種血瘀證，現(xiàn)代藥理實驗研究表明[15-17]，當(dāng)歸含有揮發(fā)油、阿魏酸等多種有效成分，可保護(hù)心血管內(nèi)膜細(xì)胞，降低血液黏度，抑制血小板聚集，增強(qiáng)血流動力，促進(jìn)微循環(huán)并改善血液流變性，從而對心血管系統(tǒng)發(fā)揮良好的保護(hù)作用。中藥經(jīng)酒制后可增強(qiáng)其活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)及引藥上行等作用[18]，“病在頭面及手梢皮膚者，須用酒炒制借酒力以上騰之。咽之下臍之上須酒洗之。酒浸，助發(fā)之意也”[7]。當(dāng)歸經(jīng)過酒洗后長于活血化瘀[19]，研究表明，當(dāng)黃酒用量過少時，飲片太硬，而黃酒用量過多時，飲片則過疏散，并且難以吸收完全。干預(yù)實驗結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)黃酒用量在10～20 g時，飲片性狀較好。與單因素實驗相比，在正交實驗及其工藝驗證實驗當(dāng)中適當(dāng)擴(kuò)大了樣品用量，兩者使用質(zhì)量相同是為了平衡比較，但適當(dāng)擴(kuò)大樣品用量有利于優(yōu)選穩(wěn)定性工藝，為以后酒洗當(dāng)歸飲片中試生產(chǎn)提供基礎(chǔ)依據(jù)。

本研究以阿魏酸、藁本內(nèi)酯等多種成分含量及外觀性狀評分為指標(biāo)，考察酒精濃度、用酒量、干燥溫度對酒洗當(dāng)歸質(zhì)量的影響，優(yōu)選酒洗當(dāng)歸炮制工藝參數(shù)。結(jié)果顯示：當(dāng)歸飲片每100 g加15%的黃酒20 g，干燥溫度為40 ℃時，有效成分含量較高，工藝穩(wěn)定，外觀性狀良好。本研究建立了酒洗當(dāng)歸多成分含量測定的方法，可為以后酒洗當(dāng)歸的規(guī)范化生產(chǎn)提供參考和依據(jù)。